**Francesca Masin
*Stefano Manfredini
**Silvia Vertuani
Le materie prime di derivazione biotecnologica sono sempre più di attualità nella formulazione dei cosmetici. Sono frutto della moderna ricerca scientifica che tende a valorizzare sostenibilità, tradizione e innovazione.
Uno dei processi maggiormente impiegati nella produzione di questi ingredienti è la chimica
della fermentazione.
Il settore cosmetico si contraddistingue per una continua e instancabile ricerca di prodotti innovativi che soddisfano le esigenze del consumatore per funzionalità ed estetica, in linea con i sempre più dinamici e fluidi trend di mercato, non dimenticando tuttavia l’importanza delle proprie responsabilità sociali e ambientali. Il prodotto cosmetico, dunque, è il risultato di una strategia per nulla lasciata al caso che volge lo sguardo verso prodotti tecnicamente complessi, sostenibili e frutto di studi all’avanguardia, un esempio sono i “cosmetici fermentati”, presenti ormai da alcuni anni sul mercato mondiale, in particolare quello orientale. Esaminando il termine in sé si può intuire l’azzardo linguistico, infatti il cosmetico fermentato finito e pronto all’acquisto non è fermentato come può far pensare il termine, bensì è caratterizzato da uno o più ingredienti ottenuti da biotecnologie, più precisamente dalla chimica della fermentazione. La presenza di queste materie prime ottenute da biotecnologie è spesso il claim accattivante dell’intero prodotto, spesso è il focus di un’intera linea con un’inclinazione più commerciale, tuttavia il valore della materia prima di derivazione biotecnologica è il riflesso di una coscienza più ampia, che abbraccia ricerca scientifica, sostenibilità e tradizione.
Il nostro gruppo di ricerca è da diversi anni impegnato nello studio di nuovi ingredienti cosmetici più sostenibili, che derivano in particolare da fonti biotecnologiche, come per esempio lo studio dell’antiossidante verbascoside (Vertuani et al., 2011), il cui ottenimento consente di risparmiare centinaia di litri di acqua rispetto alla coltivazione in terreno. Nell’ambito dei fermentati il nostro interesse si è rivolto in questi ultimi anni ai polisaccaridi, in particolare all’acido ialuronico, con l’ottenimento di forme semisintetiche, in particolare crosslinkate, al fine di valorizzarne le proprietà salutistiche. (Fallacara et al., 2018; Fallacara et al., 2019). Infine i nostri sforzi sono rivolti non solo all’ottenimento di “specialties” ma anche di “commodities” utili a sostituire, con forme sostenibili, i tradizionali ingredienti da petrolchimica particolarmente impattanti sull’ambiente: es. emulsionanti, viscosizzanti e conservanti da via fermentativa.
È nostra premura chiarire il termine biotecnologie oggi utilizzato per identificare unicamente processi connessi alle tecniche del DNA ricombinante e OGM, in realtà secondo Unite Nations Convention on Biological Diversity “è qualsiasi applicazione tecnologica che utilizza sistemi biologici, organismi viventi, o derivati, per fabbricare o modificare prodotti o processi per uso specifico” (Taussig et al., 2008) e dunque comprende anche quelle tecniche che producono cellule microbiche come prodotto (biomassa), enzimi microbici, metaboliti microbiologici e prodotti ricombinanti attraverso varie e complesse tecnologie tra cui anche la fermentazione. L’utilizzo delle tecniche biotech ha determinato un impatto positivo sia economico che sociale nel tessuto lavorativo, infatti osservando il rapporto sulle biotecnologie in Italia, realizzato da Assobiotec, Associazione nazionale per lo sviluppo delle biotecnologie, in collaborazione con ENEA circa i dati forniti dalle imprese biotech a fine 2018, si delinea un crescente interesse socio economico, un fatturato in crescita del 16% e un numero di addetti pari a 13.000 unità, riportando un incremento significativo di un settore caratterizzato da un’intensa attività di ricerca e una popolazione di impresa sempre più in aumento. Da questi dati emerge il potenziale umano ed economico di un settore dedito alla ricerca, alla sperimentazione e allo sviluppo di molteplici tecnologie, pur essendo eterogeno nei diversi ambiti di applicazione.
Oltre la metà delle imprese italiane censite è rappresentata dalle biotecnologie dedite alla salute dell’uomo; si parla di biotecnologia rossa o della salute, caratterizzata da un’ampia e consolidata categoria di prodotti, come i farmaci biotecnologici, finalizzati a raggiungere in modo mirato un singolo bersaglio, una proteina, un recettore o anche una sequenza del DNA. Si pensi per esempio agli anticorpi monoclonali, come gli inibitori del TNF-a (per esempio l’INFLIXIMAB), o ai prodotti ottenuti dalla tecnica del DNA ricombinante, questi ultimi sono caratterizzati dal trasferimento di un gene di interesse, per esempio un gene umano, codificante per una specifica proteina che si vuole utilizzare come farmaco, questo è inserito in un organismo ospite che viene successivamente fatto crescere in un fermentatore e sarà capace di secernere la proteina codificata dal gene inserito. Sono moltissimi gli esempi che hanno sfruttato questa tecnica come per esempio l’insulina, si pensi al farmaco pionieristico Humulin, ottenuto utilizzando l’Escherichia coli (Walsh et al., 2005; Wick et al., 2017) o al farmaco per la terapia dell’acromegalia Pegvisomant, antagonista del recettore dell’ormone della crescita ottenuto utilizzando ancora una volta E. coli (Goeddel et al., 1979; Trainer et al.,2000), o all’interferone per la terapia dell’epatite C.
Tuttavia le biotecnologie coinvolgono moltissimi altri settori come quello dell’agricoltura, si parla in questo caso di biotecnologia verde rivolta in particolare a una maggiore aderenza alla sostenibilità, al biologico o ancor meglio all’idroponico. Le biotecnologie bianche invece sono rivolte alla produzione di sostanze e prodotti di consumo di massa, per esempio biotecnologie che guardano allo sviluppo di prodotti innovativi nell’ambito alimentare, cosmetico, energetico. La scelta di questo tipo di tecnologie determina in primis un notevole risparmio in termini di denaro, tempo e infrastrutture riducendo allo stesso tempo scarti inquinanti e l’uso di acqua, dal momento che si avvale prevalentemente di enzimi, lieviti e di cellule vegetali. Sarebbe tuttavia limitante ed errato affermare, come già premesso, che le biotecnologie si avvalgono esclusivamente di modifiche genomiche e tecniche di ingegneria genetica Negli ultimi anni in particolare nell’ambito delle biotecnologie verde e bianca stanno acquisendo sempre più interesse tecniche note nel passato, storicamente inserite nel contesto culturale, specie italiano, come per esempio la fermentazione.
Meccanismi ossidativi e tecnologia
Il concetto di fermentazione può essere considerato secondo due modalità che non si escludono tra loro, una biochimica, l’altra rivolta a un’ottica più industriale. Il termine fermentazione indica un processo biochimico catabolico dei composti organici, funzionale alla rigenerazione del NADH, ossia alla sua ossidazione. Il catabolismo degli zuccheri infatti è un processo ossidativo che produce, durante alcune tappe della glicolisi piridin nucleotidi ridotti (NADH), i quali devono essere riossidati per continuare il processo catabolico. In presenza di ossigeno, l’equivalente riducente, cioè la coppia di elettroni, immagazzinato nel NADH, è ceduto tramite un sistema di trasporto al mitocondrio, dunque in questo caso grazie all’ossigeno si ossida. Al contrario se l’ossigeno non è sufficiente, condizione di anaerobiosi, il NADH rimane ridotto bloccando il processo di produzione di energia nella cellula. Per evitare ciò ha inizio la fermentazione che è finalizzata proprio all’ossidazione del NADH a NAD+; in questo caso l’equivalente riducente è accettato dal piruvato, che sarà ridotto fungendo da ossidante nei confronti del NADH. Durante un intenso sforzo muscolare, in caso di basse concentrazioni di ossigeno, la produzione di ATP sarebbe compromessa, perciò le cellule del muscolo hanno creato un meccanismo alternativo come la fermentazione lattica proprio per evitare lo stop della glicolisi; la reazione è catalizzata dall’enzima lattato deidrogenasi, il piruvato è trasformato in lattato e contemporaneamente il NADH è ossidato. Anche i microrganismi sono in grado di ridurre il piruvato a una vasta gamma di prodotti finali: il piruvato che si forma dal catabolismo del glucosio è successivamente metabolizzato a seconda di meccanismi che sono caratteristici dei particolari microrganismi. Dunque in questo caso il termine fermentazione viene usato in stretto senso biochimico e indica un processo di produzione di energia.
I microbiologi industriali invece considerano il termine fermentazione nella sua accezione più ampia, usando questo termine per descrivere tutti quei processi che portano a nuovi prodotti per mezzo di colture di microrganismi. Ancor più esaustiva la definizione di fermentazione data da Hussain et al. (2016), definita come un processo guidato da un microrganismo che, partendo da un substrato di basso valore (low grade), lo converte e lo elabora sotto l’azione di enzimi microbici, creando nuovi composti bioattivi.
Come premesso all’inizio di questa trattazione, la definizione di cosmetico fermentato, per i non addetti al settore può essere confuso, senza colpa, con un immaginario cosmetico contenente cellule biologicamente attive e vitali alla stregua di alcuni prodotti alimentari, come per esempio lo yogurt, che per definizione è latte fermentato. Ma lo yogurt, come è noto, è ottenuto attraverso una serie di step controllati e successivi tra cui l’aggiunta di microrganismi, nello specifico Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus, coltivati direttamente sul latte precedentemente pastorizzato e lasciati fermentare. Durante il processo avvengono profonde trasformazioni di natura fisica, chimica, batteriologica, organolettica e nutrizionale che modificano le caratteristiche del latte e portano all’ottenimento dello yogurt. È necessario considerare che le proprietà del prodotto ottenute durante la fermentazione, come per esempio l’abbassamento del ph a 4,5 o la presenza dell’acido lattico nella percentuale dello 0,8-1,4%, sono legate alla presenza, fino all’atto del consumo dei suddetti microrganismi; essi infatti devono essere vivi e vitali in quantità totale non minore di 10 milioni (107) per grammo di prodotto. Negli ultimi anni inoltre sono addizionati probiotici, cioè veri e propri ceppi batterici, che conferiscono all’ospite, non più al prodotto, benefici specifici (Parvez et al., 2006).
Da questa breve descrizione della fermentazione per l’ottenimento dello yogurt è chiara la condizione completamente differente rispetto a un prodotto cosmetico contenente ingredienti o attivi di derivazione biotecnologica. Il termine “cosmetico fermentato” manifesta la scelta di una tecnologia biotech, basata sulla chimica delle fermentazioni, in cui è stata preferita la fermentazione come tecnica di produzione di alcuni componenti. Il cosmetico non può contenere cellule biologicamente attive, sarebbe di certo instabile a livello chimico, organolettico, microbiologico e anche poco accattivante tuttavia può caratterizzarsi di materie prime ottenute da un processo fermentativo. Dunque il comune denominatore tra prodotti alimentari fermentati e cosmetici fermentati è l’utilizzo di una tecnica antica e resa oggigiorno sempre più all’avanguardia in cui i microrganismi guidano l’intero processo di ottenimento della materia in oggetto.
Biopolimeri e applicazioni nell’industria
Tra i biopolimeri presenti nel panorama delle applicazioni tecnologiche cosmetiche e biomediche la gommma xantana è tra gli esempi più noti e conosciuti. La sua scoperta infatti risale al 1950, da parte di Allen Rosalind Jeanes del Dipartimento di Agricoltura degli Stati Uniti, il suo potenziale è da subito riconosciuto prima in ambito alimentare tant’è che è approvato come polimero non tossico e sicuro da FDA nel 1969, trovando principale applicazione come agente viscosizzante e stabilizzante, poi anche in ambito cosmetico e biomedico. La gomma xantana è, di fatto, il secondo polisaccaride, ottenuto da microrganismo dopo il destrano (inizi del 1940) e commercializzato in scala industriale. In Europa la gomma xantana è prodotta su larga scala da Jungunzlauer Autria AG e Solvay, tuttavia dal 2005 il principale produttore al mondo è la Cina. Il polimero è tra i gli esempi di ingredienti ottenuti da fermentazione con una consolidata storia di applicazioni in differenti ambiti tra loro trasversali, e pur essendo conosciuta da anni è ancora molto fervida la ricerca per nuove applicazioni. Come noto è un polisaccaride, il cui nome deriva dalla fermentazione del glucosio usando il batterio Gram negativo del genere Xanthomonas, che presenta numerose specie, tuttavia X. campestris è il più utilizzato a livello industriale. (Kumar et al., 2018)
La struttura principale è costituita da una backbone di unità ripetute di cellobiosio mentre le ramificazioni sono caratterizzate da un trisaccaride di D-mannosio, D-acido glucuronico e D-mannosio, circa metà dei mannosi terminali contengono residui di acido piruvico legati in posizione 4 e 6, tuttavia la loro distribuzione è sconosciuta, mentre è certa la presenza di un acetile in posizione 6 del primo mannosio della catena laterale. La composizione della xantana, in particolare delle sue ramificazioni, dipende dalle condizioni di fermentazione e dalle caratteristiche del batterio in uso, che andranno a influenzare le differenti caratteristiche del prodotto, poiché la struttura ramificata favorisce non solo la costruzione di reti fisiche ma anche quelle chimiche (Petri et al., 2015). A fermentazione conclusa segue un processo di pastorizzazione per eliminare i microrganismi, la gomma è fatta precipitare in alcol, spry-dried o risospeso in acqua e fatta riprecipitare. Tuttavia per le applicazioni in vivo è purificata secondo un protocollo in cui sono previsti step precisi (adsorbimento, enzimolisi, filtrazione e precipitazione) al fine di raggiungere un alto grado di purificazione.
Questo prodotto di derivazione biotech, ottenuto da fermentazione microbica, ha svariate applicazioni tecnologiche. È principalmente utilizzato nel settore alimentare e cosmetico come viscosizzante acquoso, con range di utilizzo tra 0,05 e 0,7%. La sua versatilità è data anche dalla stabilità in un ampio range di pH, di temperatura e di forze ioniche. In ambito cosmetico è utilizzato nei dentifrici, negli shampoo, lozioni, geli acquosi ed emulsioni olio in acqua, ritardando in questi ultimi i fenomeni di coalescenza. Recentemente è stata utilizzata anche nei prodotti da forno per evitare la migrazione dell’acqua dal ripieno alla sfoglia. È stato aggiunto nei prodotti gluten-free grazie all’elasticità che riesce a conferire a tali prodotti. In ambito farmaceutico la gomma xantana è presente come eccipiente principalmente nelle compresse e all’interno di idrogeli come viscosizzante (Petri et al., 2015).
Le sue applicazioni eterogenee sono date principalmente dalla conformazione della gomma che può alternarsi da una conformazione a bobina (coil) a una struttura a doppia elica. La persistenza di una piuttosto che dell’altra è influenzata da vari fattori come la temperatura e la forza ionica delle catene, oltre che dalla presenza di ioni Ca2+ che stabilizzano la struttura a elica, ma soprattutto la formazione di network fra le singole catene. Il numero di connessioni nel network può aumentare con l’aggiunta di un crosslinker come l’acido citrico, il glicerolo o la glutaraldeide, creando ponti con altri polimeri come la cellulosa, il chitosano o i poliacrilati. (Bueno et al., 2014). Inoltre può essere utilizzata come carriers per farmaci e biomolecole, grazie alla sua elevata stabilità a pH acidi protegge il farmaco dalla degradazione nello stomaco e il rilascio è controllato in funzione del pH dell’ambiente (in condizioni alcaline i legami esterei sono idrolizzati), si creano dunque network che veicolano farmaci, proteine e attivi. Ogni sistema sarà ovviamente influenzato dal pH della matrice, dalla forza ionica e altri parametri. Un esempio in ambito medico è la veicolazione di omega 3, curcumina e quercetina attraverso idrogeli e microsfere a base di gomma xantana per il rilascio a livello colon rettale, al fine di trasmettere gli adiuvanti nella terapia del cancro al colon. (Trombino et al., 2019). Infine idrogel a base di gomma xantana sono studiati per l’ottenimento di scaffolds celluari data la sua natura biocompatibile e biodegradabile. (Del Agua et al., 2018) Dunque una molecola semplice ma, grazie alle sue caratteristiche e sicurezza, decisamente poliedrica.
Altro polimero particolarmente noto in ambito biotecnologico è l’acido ialuronico (HA), molecola molto attrattiva per elevata igroscopicità, natura viscoelastica, biocompatibilità, non immunogenicità e assenza di tossicità durante la degradazione. La scoperta dell’acido ialuronico risale alla fine del 1800, quando il chimico francese Portes notò nel corpo vitreo, una mucina che chiamò “hyalomucine” perché differente da altre sostanze mucoidi. Successivamente, nel 1934, Meyer e Palmer descrissero la procedura di isolamento dall’occhio bovino di una nuova glicosaminoglicana, e la denominarono acido ialuronico. Il polimero è presente in tutto l’organismo, per la maggior parte nella pelle e in un uomo di 70 kg rappresenta circa 15 mg del peso totale (Boeriu et al., 2013).
Tradizionalmente è estratto dalla cresta del gallo, però questa metodica presentava diversi svantaggi tra cui la perdita di HA per degradazione da parte dell’enzima endogeno ialuronidasi, elevati costi durante l’estrazione e una complessa purificazione del biopolimero poiché il tessuto animale poteva presentare contaminanti virali. Scoraggiati da questa pratica si sono sviluppati percorsi alternativi per la produzione del biopolimero come la fermentazione microbica, l’acido ialuronico infatti è presente non solo in tutti i vertebrati ma anche nelle capsule di numerosi microrganismi patogeni come Pasteurella multocida e nelle capsule dei gruppi A e C dello Streptococco in particolare in Streptococcuss pyogenes, patogeno per l’uomo, e in due batteri patogeni per gli animali come S. equi e S. uberis. I batteri produttori di HA si caratterizzano da una struttura saccaridica a livello della capsula che favorisce l’adesione del batterio, segue la sua colonizzazione e l’assenza di una risposta immunitaria da parte dell’ospite, se così fosse ci sarebbero in quel caso complicazioni autoimmuni (De Angelis et al., 1999). Pasteurella multocida è un Gram negativo, patogeno delle vie aeree di maiali e vitelli, nonostante sia un produttore naturale di HA a oggi non è utilizzato a livello industriale probabilmente per la sua patogenicità (De Angelis et al., 1998). Al contrario sono una fonte eccellente per la produzione del biopolimero i batteri del genere Streptococcus. Già dai primi anni di sviluppo industriale la produzione attraverso fermentazione batterica con streptococchi si è rivolta a ottimizzare i mezzi di coltura, le condizioni di coltivazione, la resa ialuronica e la qualità del prodotto, tuttavia vi sono alcune sfide a oggi irrisolte come il tentativo di aumentare la resa per far fronte alla crescente richiesta del mercato, uno dei fattori limitanti è per esempio l’alta viscosità del brodo di fermentazione (De Oliveira et al., 2016).
Sono noti anche alcuni microrganismi eucarioti capaci di sintetizzare il polimero, come il lievito Cryptococcus neoformans e l’alga verde unicellulare Chlorella. In quest’ultima la produzione di HA si verifica solo durante l’infezione virale da Chlorovirus, un virus a doppio filamento di DNA che permette l’espressione di un particolare gene dell’alga che causa la secrezione esterna di HA a livello della membrana cellulare (Mohammed Ali et al., 2005). Cryptococcus neoformans invece è un fungo patogeno, che causa meningoencefaliti letali in pazienti immuocompromessi, è però capace di secernere acido ialuronico che gioca un ruolo fondamentale nell’adesione a livello delle cellule endoteliali (Jong et al.2007); vista la sua pericolosità non è utilizzato per la produzione del polimero.
Data la presenza dell’enzima HAS, enzima responsabile nella sintesi del biopolimero, e il suo ottimo profilo di sicurezza, tra le specie più utilizzate in ambito industriale emerge Streptococcus zooepidermicus tuttavia il processo di produzione del polimero attraverso fermentazione con S. zooepidermicus è proprietaria la società giapponese Shiseido, dunque non accessibile al mercato se non su vendita diretta dell’azienda nipponica che ora non lo rende disponibile perché utilizzato per i propri consumi interni. In questo periodo è condotta una fervida ricerca al fine di migliorare la tecnica eterologa, che consta nello sfruttare un ospite geneticamente modificato reso capace di produrre HA, il fine primo è utilizzare microrganismi non patogeni, più facilmente manipolabili durante il processo industriale di fermentazione e produrre un acido ialuronico di qualità simile o superiore rispetto a quello coperto da brevetto di Shiseido. L’evoluzione di questa metodica, utilizzando in particolare Escherichia coli, ha consentito di sopperire alla domanda di acido ialuronico, tuttavia presenta maggiori problematiche a livello di purificazione. Infatti, mentre S. zooepidermicus produce HA come parte della capsula, il batterio Gram negativo E. coli lo produce internamente, rappresentando dunque un problema di purificazione. Sono numerosi i microrganismi geneticamente modificati utilizzati per la produzione di acido ialuronico per esempio: Lactobacillus lactis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptomyces albulus, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Pichia pastoris (De Oliveira et al., 2016). Tuttavia a oggi la resa e la qualità del prodotto non hanno raggiunto quello ottenuto da fermentazione naturale.
Ricerche in corso
Da alcuni anni sono condotti numerosi studi per valutare le differenze quali e quantitative tra prodotti non fermentati e fermentati, in questi ultimi è stata riscontrata una maggiore presenza di attivi come peptidi, pigmenti, polisaccaridi, fenoli ecc. rispetto ai composti non fermentati, spesso accompagnati da proprietà biologiche e fisiologiche interessanti. Alcuni studi sul ginseng fermentato, in particolare Panax ginseng Meyer fermentato con Bacillus subtilis, hanno rivelato un contenuto totale di zuccheri, polisaccaridi, contenuto fenolico e di acido cumarico maggiore rispetto al ginseng non fermentato e come ci si può aspettare anche una maggiore attività antiossidante (Lee et al., 2015).
Anche la fermentazione della soia confrontata con quella non fermentata ha dato dei risultati interessanti, è stato valutato il contenuto di attivi della soia fermentata con Bacillus subtilis e l’estratto non fermentato. La valutazione dell’attività antiossidante attraverso DPPH ha evidenziato alla concentrazione 1 µl/mL un valore percentuale per l’estratto fermentato pari a 72.60±3.71, per l’estratto non fermentato 55.44±0.26 e per il controllo positivo (vitamina C) 66.79±1.02. I dati ottenuti avvalorano l’utilizzo della soia nei prodotti skin aging proprio per le sue note proprietà antiossidanti riconosciute. (Cha et al.,2011)
Tra gli aspetti che influenzano maggiorente il fermentato, andando a ripercuotersi sulle caratteristiche quali e quantitative del prodotto finito in termini di proprietà, vi è la composizione del brodo utilizzato nella fermentazione, dunque del medium. Riportiamo questo report che analizza la capacità antiossidante e le molecole caratterizzanti della soia nera fermentata con B. subtilis fermentato in tre differenti medium di coltura. È stata valutata la composizione amminoacidica, fenoli totali, flavonoidi e antocianine, infine le proprietà antiossidanti. I risultati indicano che l’utilizzo dei tre differenti brodi ha determinato prodotti che, pur caratterizzati da un’attività antiossidante, presentano valori differenti e lo stesso vale per il contenuto di amminoacidi essenziali, fenoli, flavonoidi e antocianine (Lin et al., 2012).
Ricordiamo infine che la fermentazione può aumentare l’attività fisiologica e biochimica dei substrati, a dimostrazione è stato condotto uno studio sulla radice di Angelica dahurica, una pianta medicinale cinese, caratterizzata da un’interessante attività antiossidante. Lo studio ha previsto il confronto tra l’estratto acquoso fermentato con Lactobacillus acidophilus e l’estratto non fermentato. È stato valutato il contenuto di melanina di una determinata linea cellulare (B16F10), l’attività antitirosinasi e l’attività antiossidante. Il prodotto fermentato è in grado di inibire le tirosinasi e ridurre il contenuto di melanina, in particolare a 1.5mg/mL riduce in maniera significativa l’attività delle tirosinasi a livello cellulare, riducendo quindi il contenuto di melanina. I risultati hanno evidenziato che L. acidophilus è il miglior ceppo batterico tra i quattro testati a inibire l’attività delle tirosinasi, IC50 0.07±0.03 mg/mL, decisamente migliore rispetto al non fermentato, IC50 8.20±0.35 mg/mL e più basso rispetto al controllo dell’acido kojico, IC50 0.02±0.008 mg/mL. Il contenuto di melanina delle cellule B16F10 è dose dipendente, a 1,5 mg/mL di estratto acquoso fermentato con L. acidophilus è stata registrata una riduzione fino allo 0% di melanina. Esso rappresenta dunque un candidato interessante per lo sviluppo di formulazioni cosmetiche skin-whitening.
Per quanto concerne l’attività antiossidante, valutata mediante DPPH, i risultati hanno evidenziato per il campione estratto in acqua distillata e fermentato con L. acidophilus, il valore più alto IC50 0.12±0.01 mg/mL, più alto anche del controllo BHT IC50 1.13±0.31mg/mL. È stato poi riscontrato una modifica del potere riducente in funzione del solvente di estrazione e dal tipo di batterio utilizzato per la fermentazione, il campione, estratto con il solvente etanolo al 70% non fermentato, ha dato il valore peggiore tra tutti i solventi di estrazione utilizzati pari a 2.806 mg/mL, mentre il valore del potere riducente dei campioni fermentati variano a seconda del ceppo batterico, Bifidobacterium bifidum (IC50 1.80±0.08 mg/mL), Bifidobacterium lactis (IC50 2.75±0.10mg/mL), Lactobacillus acidophilus (IC50 1.02±0.03mg/mL), Lactobacillus brevis(IC50 1.26±0.10 mg/mL), come è possibile notare hanno valori più alti rispetto al non fermentato IC50 2.80±0.36 mg/mL. Infine è stata valutata la componente fenolica degli estratti fermentati e non, tramite HPLC: entrambi sono caratterizzati dalla predominanza di acido caffeico e acido rosmarinico, tuttavia i fermentati contengono ben undici composti fenolici contro i cinque del campione non fermentato (Wang et al., 2017).
Da questi dati è possibile concludere che la fermentazione ha determinato modifiche sia dei composti fenolici biosintetizzati che della loro quantità. Dunque, la selezione della specie utilizzata nella fermentazione e il solvente di estrazione è fondamentale per la qualifica dei prodotti fermentati.
Claim e prospettive
Negli ultimi anni è sempre più frequente ritrovare prodotti contenenti attivi derivanti da fermentazione spesso valorizzati in etichetta con claim accattivanti, esaltando gli effetti ottenibili da questi prodotti. Purtroppo non sempre sono condotti test di efficacia o accertamenti del contenuto e della concentrazione delle molecole a cui è imputabile l’attività che sostiene il claim, in alcuni casi non sono eseguiti con metodo prettamente scientifico in altri casi si assiste a vere e proprie adulterazioni.
Un esempio di conservante biologico ottenuto da fermentazione, tuttavia adulterato con componenti di sintesi, è il Leuconostoc/radish root ferment filtrate. Questo conservante di grado alimentare e cosmetico è ottenuto da una varietà di ravanello originario dell’Asia, Raphanus sativus, fermentato con Leuconostoc kimchii, un batterio Gram positivo, e vanta una spettro d’azione molto ampio comprendente Gram positivi e negativi e funghi.
In letteratura è noto come la fermentazione di Leuconostoc kimchii sia una potenziale risorsa di peptidi antimicrobici, appartenenti alla classe delle batteriocine. Un noto esempio ottenuto dalla fermentazione di batteri dell’acido lattico è la nisina A (conservante noto da più di 40 anni), tuttavia la loro attività non permette la copertura di uno spettro d’azione così ampio quanto dichiarato dai claims commerciali del prodotto. Bisogna pertanto fare attenzione alle adulterazioni perché alcuni studi effettuati sul conservante Leuconostoc/radish root ferment filtrate hanno rivelato la presenza di acido salicilico e sali di ammonio quaternario (didecyldimethylammonium), molecole non ottenute chiaramente dalla fermentazione bensì di origine sintetica come ha confermato l’analisi del C14 (Li et al, 2015).
Nonostante vi siano numerosi conservanti ottenuti da fermentazione con un reale spettro d’azione purtroppo vi sono tutt’oggi adulterazioni: eclatante è caso degli estratti di pompelmo adulterati con cloruro di benzetonio, che purtroppo non è isolato (Takeoka et al., 2001).
Il futuro riserva grandi spazi alle tecnologie fermentative nella realizzazione di ingredienti per uso cosmetico, basandosi soprattutto su fonti tradizionali ma senza escludere applicazioni innovative che combinino tradizione e innovazione. Anche i grandi gruppi industriali hanno rivolto attenzione a queste tecnologie in un’ottica di sostenibilità ambientale: biotecnologie controllate possono portare a ottenere, senza consumo di terreno utile alle produzioni agricole alimentari per sfamare il pianeta, materie prime come la fragranza di rosa o aromi. La partnership tra GinkgoBioworks e Robertet è stata un primo motore di innovazione negli ingredienti in coltura, concentrandosi su prodotti come gli ingredienti dell’olio di rosa e una famiglia di ingredienti a base lattonica. Gli ingredienti in coltura sono un settore in crescita nell’ambito degli aromi e dei profumi ma anche di altre industrie come quella alimentare e quella cosmetica. Questi ingredienti sono prodotti da lieviti durante la fermentazione, un processo simile alla produzione della birra. Dopo la fermentazione, l’ingrediente è separato dalle cellule di lievito e può essere utilizzato come altri prodotti convenzionali.
Lavorando con uno dei loro partner, dediti a Flavoring&Fragrance, è stata sfruttata una via metabolica, già esistente in un lievito, per produrre un ingrediente dal sapore importante in modo più efficiente, sono state migliorate razionalmente le condizioni del ceppo e della fase di fermentazione, superando del 50% il titolo del prodotto desiderato dal cliente. Inoltre, le condizioni ottimizzate a un volume di soli 250 mL sono state efficacemente tradotte in scala pilota a 300 L e in produzione commerciale a 50.000 L.
Concludendo si può affermare che i cosmetici “fermentati” rappresentano una importante categoria di prodotti caratterizzati da ingredienti che derivano dalla biotecnologia fermentativa; la loro rilevanza risiede sia nelle proprietà intrinseche dei prodotti di fermentazione che dalla tradizione della tecnica ottimizzata durante tutta la storia dell’uomo. Questi prodotti presentano proprietà fondamentali largamente sfruttate nel mercato cosmetico e non solo, ma soprattutto vantano un impatto ambientale e sociale rivolto alla sostenibilità, dal momento che sono utilizzate fonti rinnovabili, e non di origine petrolchimica, le quali consentono di risparmiare terreno e acque per le colture alimentari.
* Membro del “Tavolo delle Biotecnologie per la Cosmetica” presso Assobiotech/Federchimica, Milano.
** UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FERRARA, Dipartimento di Scienze della Vita e Biotecnologie, Master di II Livello in Scienza e Tecnologia Cosmetiche, Facoltà di Medicina, Farmacia e Prevenzione
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Natural 1
Il settore cosmetico si contraddistingue per una continua e instancabile ricerca di prodotti innovativi che soddisfano le esigenze del consumatore per funzionalità ed estetica, in linea con i sempre più dinamici e fluidi trend di mercato, non dimenticando tuttavia l’importanza delle proprie responsabilità sociali e ambientali. Il prodotto cosmetico, dunque, è il risultato di una strategia per nulla lasciata al caso che volge lo sguardo verso prodotti tecnicamente complessi, sostenibili e frutto di studi all’avanguardia, un esempio sono i “cosmetici fermentati”, presenti ormai da alcuni anni sul mercato mondiale, in particolare quello orientale. Esaminando il termine in sé si può intuire l’azzardo linguistico, infatti il cosmetico fermentato finito e pronto all’acquisto non è fermentato come può far pensare il termine, bensì è caratterizzato da uno o più ingredienti ottenuti da biotecnologie, più precisamente dalla chimica della fermentazione. La presenza di queste materie prime ottenute da biotecnologie è spesso il claim accattivante dell’intero prodotto, spesso è il focus di un’intera linea con un’inclinazione più commerciale, tuttavia il valore della materia prima di derivazione biotecnologica è il riflesso di una coscienza più ampia, che abbraccia ricerca scientifica, sostenibilità e tradizione.
Il nostro gruppo di ricerca è da diversi anni impegnato nello studio di nuovi ingredienti cosmetici più sostenibili, che derivano in particolare da fonti biotecnologiche, come per esempio lo studio dell’antiossidante verbascoside (Vertuani et al., 2011), il cui ottenimento consente di risparmiare centinaia di litri di acqua rispetto alla coltivazione in terreno. Nell’ambito dei fermentati il nostro interesse si è rivolto in questi ultimi anni ai polisaccaridi, in particolare all’acido ialuronico, con l’ottenimento di forme semisintetiche, in particolare crosslinkate, al fine di valorizzarne le proprietà salutistiche. (Fallacara et al., 2018; Fallacara et al., 2019). Infine i nostri sforzi sono rivolti non solo all’ottenimento di “specialties” ma anche di “commodities” utili a sostituire, con forme sostenibili, i tradizionali ingredienti da petrolchimica particolarmente impattanti sull’ambiente: es. emulsionanti, viscosizzanti e conservanti da via fermentativa.
È nostra premura chiarire il termine biotecnologie oggi utilizzato per identificare unicamente processi connessi alle tecniche del DNA ricombinante e OGM, in realtà secondo Unite Nations Convention on Biological Diversity “è qualsiasi applicazione tecnologica che utilizza sistemi biologici, organismi viventi, o derivati, per fabbricare o modificare prodotti o processi per uso specifico” (Taussig et al.,2008) e dunque comprende anche quelle tecniche che producono cellule microbiche come prodotto (biomassa), enzimi microbici, metaboliti microbiologici e prodotti ricombinanti attraverso varie e complesse tecnologie tra cui anche la fermentazione. L’utilizzo delle tecniche biotech ha determinato un impatto positivo sia economico che sociale nel tessuto lavorativo, infatti osservando il rapporto sulle biotecnologie in Italia, realizzato da Assobiotec, Associazione nazionale per lo sviluppo delle biotecnologie, in collaborazione con ENEA circa i dati forniti dalle imprese biotech a fine 2018, si delinea un crescente interesse socio economico, un fatturato in crescita del 16% e un numero di addetti pari a 13.000 unità, riportando un incremento significativo di un settore caratterizzato da un’intensa attività di ricerca e una popolazione di impresa sempre più in aumento. Da questi dati emerge il potenziale umano ed economico di un settore dedito alla ricerca, alla sperimentazione e allo sviluppo di molteplici tecnologie, pur essendo eterogeno nei diversi ambiti di applicazione.
Oltre la metà delle imprese italiane censite è rappresentata dalle biotecnologie dedite alla salute dell’uomo; si parla di biotecnologia rossa o della salute, caratterizzata da un’ampia e consolidata categoria di prodotti, come i farmaci biotecnologici, finalizzati a raggiungere in modo mirato un singolo bersaglio, una proteina, un recettore o anche una sequenza del DNA. Si pensi per esempio agli anticorpi monoclonali, come gli inibitori del TNF-α (per esempio l’INFLIXIMAB), o ai prodotti ottenuti dalla tecnica del DNA ricombinante, questi ultimi sono caratterizzati dal trasferimento di un gene di interesse, per esempio un gene umano, codificante per una specifica proteina che si vuole utilizzare come farmaco, questo è inserito in un organismo ospite che viene successivamente fatto crescere in un fermentatore e sarà capace di secernere la proteina codificata dal gene inserito. Sono moltissimi gli esempi che hanno sfruttato questa tecnica come per esempio l’insulina, si pensi al farmaco pionieristico Humulin, ottenuto utilizzando l’Escherichia coli (Walsh et al., 2005; Wick et al., 2017) o al farmaco per la terapia dell’acromegalia Pegvisomant, antagonista del recettore dell’ormone della crescita ottenuto utilizzando ancora una volta E. coli (Goeddel et al., 1979; Trainer et al., 2000), o all’interferone per la terapia dell’epatite C.
Tuttavia le biotecnologie coinvolgono moltissimi altri settori come quello dell’agricoltura, si parla in questo caso di biotecnologia verde rivolta in particolare a una maggiore aderenza alla sostenibilità, al biologico o ancor meglio all’idroponico. Le biotecnologie bianche invece sono rivolte alla produzione di sostanze e prodotti di consumo di massa, per esempio biotecnologie che guardano allo sviluppo di prodotti innovativi nell’ambito alimentare, cosmetico, energetico. La scelta di questo tipo di tecnologie determina in primis un notevole risparmio in termini di denaro, tempo e infrastrutture riducendo allo stesso tempo scarti inquinanti e l’uso di acqua, dal momento che si avvale prevalentemente di enzimi, lieviti e di cellule vegetali. Sarebbe tuttavia limitante ed errato affermare, come già premesso, che le biotecnologie si avvalgono esclusivamente di modifiche genomiche e tecniche di ingegneria genetica Negli ultimi anni in particolare nell’ambito delle biotecnologie verde e bianca stanno acquisendo sempre più interesse tecniche note nel passato, storicamente inserite nel contesto culturale, specie italiano, come per esempio la fermentazione.
Meccanismi ossidativi e tecnologia
Il concetto di fermentazione può essere considerato secondo due modalità che non si escludono tra loro, una biochimica, l’altra rivolta a un’ottica più industriale. Il termine fermentazione indica un processo biochimico catabolico dei composti organici, funzionale alla rigenerazione del NADH, ossia alla sua ossidazione. Il catabolismo degli zuccheri infatti è un processo ossidativo che produce, durante alcune tappe della glicolisi piridin nucleotidi ridotti (NADH), i quali devono essere riossidati per continuare il processo catabolico. In presenza di ossigeno, l’equivalente riducente, cioè la coppia di elettroni, immagazzinato nel NADH, è ceduto tramite un sistema di trasporto al mitocondrio, dunque in questo caso grazie all’ossigeno si ossida. Al contrario se l’ossigeno non è sufficiente, condizione di anaerobiosi, il NADH rimane ridotto bloccando il processo di produzione di energia nella cellula. Per evitare ciò ha inizio la fermentazione che è finalizzata proprio all’ossidazione del NADH a NAD+; in questo caso l’equivalente riducente è accettato dal piruvato, che sarà ridotto fungendo da ossidante nei confronti del NADH. Durante un intenso sforzo muscolare, in caso di basse concentrazioni di ossigeno, la produzione di ATP sarebbe compromessa, perciò le cellule del muscolo hanno creato un meccanismo alternativo come la fermentazione lattica proprio per evitare lo stop della glicolisi; la reazione è catalizzata dall’enzima lattato deidrogenasi, il piruvato è trasformato in lattato e contemporaneamente il NADH è ossidato. Anche i microrganismi sono in grado di ridurre il piruvato ad una vasta gamma di prodotti finali: il piruvato che si forma dal catabolismo del glucosio è successivamente metabolizzato a seconda di meccanismi che sono caratteristici dei particolari microrganismi. Dunque in questo caso il termine fermentazione viene usato in stretto senso biochimico e indica un processo di produzione di energia.
I microbiologi industriali invece considerano il termine fermentazione nella sua accezione più ampia, usando questo termine per descrivere tutti quei processi che portano a nuovi prodotti per mezzo di colture di microrganismi. Ancor più esaustiva la definizione di fermentazione data da Hussain et al. (2016), definita come un processo guidato da un microrganismo che, partendo da un substrato di basso valore (low grade), lo converte e lo elabora sotto l’azione di enzimi microbici, creando nuovi composti bioattivi.
Come premesso all’inizio di questa trattazione, la definizione di cosmetico fermentato, per i non addetti al settore può essere confuso, senza colpa, con un immaginario cosmetico contenente cellule biologicamente attive e vitali alla stregua di alcuni prodotti alimentari, come per esempio lo yogurt, che per definizione è latte fermentato. Ma lo yogurt, come è noto, è ottenuto attraverso una serie di step controllati e successivi tra cui l’aggiunta di microrganismi, nello specifico Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus, coltivati direttamente sul latte precedentemente pastorizzato e lasciati fermentare. Durante il processo avvengono profonde trasformazioni di natura fisica, chimica, batteriologica, organolettica e nutrizionale che modificano le caratteristiche del latte e portano all’ottenimento dello yogurt. È necessario considerare che le proprietà del prodotto ottenute durante la fermentazione, come per esempio l’abbassamento del ph a 4,5 o la presenza dell’acido lattico nella percentuale dello 0,8-1,4%, sono legate alla presenza, fino all’atto del consumo dei suddetti microrganismi; essi infatti devono essere vivi e vitali in quantità totale non minore di 10 milioni (107) per grammo di prodotto. Negli ultimi anni inoltre sono addizionati probiotici, cioè veri e propri ceppi batterici, che conferiscono all’ospite, non più al prodotto, benefici specifici (Parvez et al., 2006).
Da questa breve descrizione della fermentazione per l’ottenimento dello yogurt è chiara la condizione completamente differente rispetto a un prodotto cosmetico contenente ingredienti o attivi di derivazione biotecnologica. Il termine “cosmetico fermentato” manifesta la scelta di una tecnologia biotech, basata sulla chimica delle fermentazioni, in cui è stata preferita la fermentazione come tecnica di produzione di alcuni componenti. Il cosmetico non può contenere cellule biologicamente attive, sarebbe di certo instabile a livello chimico, organolettico, microbiologico e anche poco accattivante tuttavia può caratterizzarsi di materie prime ottenute da un processo fermentativo. Dunque il comune denominatore tra prodotti alimentari fermentati e cosmetici fermentati è l’utilizzo di una tecnica antica e resa oggigiorno sempre più all’avanguardia in cui i microrganismi guidano l’intero processo di ottenimento della materia in oggetto.
Biopolimeri e applicazioni nell’industria
Tra i biopolimeri presenti nel panorama delle applicazioni tecnologiche cosmetiche e biomediche la gommma xantana è tra gli esempi più noti e conosciuti. La sua scoperta infatti risale al 1950, da parte di Allen Rosalind Jeanes del Dipartimento di Agricoltura degli Stati Uniti, il suo potenziale è da subito riconosciuto prima in ambito alimentare tant’è che è approvato come polimero non tossico e sicuro da FDA nel 1969, trovando principale applicazione come agente viscosizzante e stabilizzante, poi anche in ambito cosmetico e biomedico. La gomma xantana è, di fatto, il secondo polisaccaride, ottenuto da microrganismo dopo il destrano (primi del 1940) e commercializzato in scala industriale. In Europa la gomma xantana è prodotta su larga scala da Jungunzlauer Autria AG e Solvay, tuttavia dal 2005 il principale produttore al mondo è la Cina. Il polimero è tra i gli esempi di ingredienti ottenuti da fermentazione con una consolidata storia di applicazioni in differenti ambiti tra loro trasversali, e pur essendo conosciuta da anni è ancora molto fervida la ricerca per nuove applicazioni. Come noto è un polisaccaride, il cui nome deriva dalla fermentazione del glucosio usando il batterio Gram negativo del genere Xanthomonas, che presenta numerose specie, tuttavia X. campestris è il più utilizzato a livello industriale. (Kumar et al., 2018)
La struttura principale è costituita da una backbone di unità ripetute di cellobiosio mentre le ramificazioni sono caratterizzate da un trisaccaride di D-mannosio, D-acido glucuronico e D-mannosio, circa metà dei mannosi terminali contengono residui di acido piruvico legati in posizione 4 e 6, tuttavia la loro distribuzione è sconosciuta, mentre è certa la presenza di un acetile in posizione 6 del primo mannosio della catena laterale. La composizione della xantana, in particolare delle sue ramificazioni, dipende dalle condizioni di fermentazione e dalle caratteristiche del batterio in uso, che andranno a influenzare le differenti caratteristiche del prodotto, poiché la struttura ramificata favorisce non solo la costruzione di reti fisiche ma anche quelle chimiche (Petri et al., 2015). A fermentazione conclusa segue un processo di pastorizzazione per eliminare i microrganismi, la gomma è fatta precipitare in alcol, spry-dried o risospeso in acqua e fatta riprecipitare. Tuttavia per le applicazioni in vivo è purificata secondo un protocollo in cui sono previsti step precisi (adsorbimento, enzimolisi, filtrazione e precipitazione) al fine di raggiungere un alto grado di purificazione.
Questo prodotto di derivazione biotech, ottenuto da fermentazione microbica, ha svariate applicazioni tecnologiche. È principalmente utilizzato nel settore alimentare e cosmetico come viscosizzante acquoso, con range di utilizzo tra 0,05 e 0,7%. La sua versatilità è data anche dalla stabilità in un ampio range di pH, di temperatura e di forze ioniche. In ambito cosmetico è utilizzato nei dentifrici, negli shampoo, lozioni, geli acquosi ed emulsioni olio in acqua, ritardando in questi ultimi i fenomeni di coalescenza. Recentemente è stata utilizzata anche nei prodotti da forno per evitare la migrazione dell’acqua dal ripieno alla sfoglia. È stato aggiunto nei prodotti gluten-free grazie all’elasticità che riesce a conferire a tali prodotti. In ambito farmaceutico la gomma xantana è presente come eccipiente principalmente nelle compresse e all’interno di idrogeli come viscosizzante (Petri et al., 2015).
Le sue applicazioni eterogenee sono date principalmente dalla conformazione della gomma che può alternarsi da una conformazione a bobina (coil) a una struttura a doppia elica. La persistenza di una piuttosto che dell’altra è influenzata da vari fattori come la temperatura e la forza ionica delle catene, oltre che dalla presenza di ioni Ca2+ che stabilizzano la struttura a elica, ma soprattutto la formazione di network fra le singole catene. Il numero di connessioni nel network può aumentare con l’aggiunta di un crosslinker come l’acido citrico, il glicerolo o la glutaraldeide, creando ponti con altri polimeri come la cellulosa, il chitosano o i poliacrilati. (Bueno et al., 2014). Inoltre può essere utilizzata come carriers per farmaci e biomolecole, grazie alla sua elevata stabilità a pH acidi protegge il farmaco dalla degradazione nello stomaco ed il rilascio è controllato in funzione del pH dell’ambiente (in condizioni alcaline i legami esterei sono idrolizzati), si creano dunque network che veicolano farmaci, proteine e attivi. Ogni sistema sarà ovviamente influenzato dal pH della matrice, dalla forza ionica e altri parametri. Un esempio in ambito medico è la veicolazione di omega 3, curcumina e quercetina attraverso idrogeli e microsfere a base di gomma xantana per il rilascio a livello colon rettale, al fine di trasmettere gli adiuvanti nella terapia del cancro al colon. (Trombino et al., 2019). Infine idrogel a base di gomma xantana sono studiati per l’ottenimento di scaffolds celluari data la sua natura biocompatibile e biodegradabile. (Del Agua et al., 2018) Dunque una molecola semplice ma, grazie alle sue caratteristiche e sicurezza, decisamente poliedrica…