Elisa Sonzogni, Marco Angarano, Giulia Martinelli, Marco Fumagalli, Nicole Maranta, Carola Pozzoli, Corinne Bani, Luigi Alberto Marrari, Chiara Di Lorenzo, Enrico Sangiovanni, Mario Dell’Agli, Stefano Piazza
Il sulforafano è un composto attivo che si forma a partire dalla glucorafanina, presente nelle verdure crucifere, dopo il loro taglio o consumo alimentare. Entrambe queste molecole arrivano fino al colon in forma stabile, ma si conosce poco sul loro effetto nella prima parte dell’intestino.
Nella celiachia, il funzionamento dell’intestino tenue è alterato dalla malattia e, nonostante la dieta senza glutine controlli i sintomi più gravi, possono persistere infiammazione e stress ossidativo. Con l’obiettivo di valutare se questi vegetali possano essere razionalmente inclusi nelle diete prive di glutine, questo studio ha confrontato l’attività biologica del sulforafano e del suo precursore glucorafanina in un modello cellulare di infiammazione indotta dalla gliadina, la proteina del glutine a cui è attribuito un ruolo chiave nella celiachia.
La malattia celiaca (MC) è una condizione autoimmune cronica, che colpisce l’intestino tenue ed è scatenata dall’ingestione di glutine in individui geneticamente predisposti. Sebbene l’adozione di rigorosi protocolli dietetici privi di glutine sia fondamentale e solitamente efficace nel controllare le gravi manifestazioni patologiche della MC, studi recenti e osservazioni cliniche suggeriscono che in alcuni pazienti possano persistere segni patologici di infiammazione e stress ossidativo, anche in assenza di glutine nella dieta. Questo aspetto sottolinea la necessità di ulteriori strategie nutrizionali o terapeutiche che possano contribuire a ripristinare l’omeostasi intestinale e mitigare questi processi infiammatori persistenti. In questo contesto, l’interesse verso composti naturali con proprietà antiossidanti e antinfiammatorie, da inserire nella dieta come alimenti o integratori alimentari, è in crescita.
I glucosinolati sono metaboliti glicosidici contenenti zolfo e azoto, presenti nelle piante appartenenti alla famiglia delle Brassicaceae. Le cultivar commestibili della specie Brassica oleracea sono ben note e consumate in tutto il mondo: cavolo, broccoli e cavolfiore rappresentano quindi per l’uomo una fonte rilevante di glucosinolati [1]. Tra queste verdure, i germogli e i semi di broccoli (Brassica oleracea var. italica Planck) sono considerati tra le fonti più ricche di questi composti, sebbene siano presenti anche nei tessuti maturi della pianta, seppure in quantità minori [2].
Il principale glucosinolato presente nei broccoli è la glucorafanina, che viene biotrasformata nell’isotiocianato sulforafano grazie all’azione della mirosinasi, un enzima presente nelle piante e nei batteri, inclusi quelli del microbiota intestinale [2]. Il sulforafano è considerato un composto biologicamente attivo di grande interesse per la salute umana; infatti, diversi autori hanno raccolto prove sul suo potenziale ruolo nella prevenzione del cancro e delle malattie cardiometaboliche [3-5]. L’effetto protettivo delle cultivar di Brassica oleracea contro il cancro al colon è stato suggerito da studi epidemiologici e preclinici [6-9]. Secondo molti autori, infatti, il sulforafano rappresenta il principale composto responsabile dell’effetto antitumorale sul colon, grazie alle sue ben note proprietà antiproliferative, antiossidanti e antinfiammatorie [3,8,9].
L’impatto dei glucosinolati sui disturbi intestinali, con particolare riferimento alle malattie di origine infiammatoria, non è ancora del tutto chiaro. Alcune recenti revisioni della letteratura hanno esaminato l’effetto dei germogli di broccoli in modelli murini di colite [10,11], sottolineando così il ruolo cruciale del contenuto di glucosinolati, suggerendo che sono necessari ulteriori studi sull’infiammazione intestinale di diversa origine per favorire la traduzione in studi clinici [11].
È importante notare che la glucorafanina è frequentemente menzionata come un composto stabile e inattivo, che necessita della sua bioconversione in sulforafano per esercitare effetti sia a livello intestinale che sistemico [2]. Coerentemente, la letteratura sugli isotiocianati si concentra sul sulforafano come struttura dotata di particolare efficacia nell’uomo, mentre i confronti biologici con il precursore glucorafanina sono rari [5]. D’altra parte, è importante considerare che la glucorafanina potrebbe rimanere stabile durante il transito nel tratto gastrointestinale fino a raggiungere l’intestino crasso [12], sollevando così l’ipotesi di una sua attività biologica anche a livello gastrico e dell’intestino tenue.
Considerando il destino metabolico dei glucosinolati, il nostro gruppo di ricerca ha ipotizzato un potenziale ruolo della glucorafanina nelle condizioni infiammatorie che colpiscono l’intestino tenue, come la MC. In linea con altri disturbi intestinali, la MC attiva è correlata a una barriera intestinale compromessa e a disbiosi [13,14]. Nella MC, la gliadina, la proteina contenuta nel glutine ritenuta responsabile della risposta immunitaria anomala dell’organismo, agisce sia come aptene immunogenico sia come agente pro-infiammatorio: sono stati descritti gli effettori infiammatori coinvolti nel processo autoimmune, come le citochine dell’immunità innata (come IL-1β) e IFN-γ, che svolgono un ruolo ben documentato [15]; al contrario, i meccanismi infiammatori coinvolti nell’effetto diretto della gliadina sugli enterociti sono ancora poco chiari. Secondo la letteratura, potrebbero includere la via di NF-κB [16], la via di JAK/STAT [17] e l’interazione con i recettori delle chemochine CXC, come CXCR3 [18].
Indipendentemente dal contesto autoimmune della MC, diversi studi hanno anche suggerito che l’omeostasi intestinale possa essere direttamente alterata da peptidi non digeriti della gliadina, i quali possono indurre stress ossidativo in diversi modelli sperimentali: per esempio, la gliadina è stata coinvolta nel danneggiamento del DNA a livello intestinale, come dimostrato dalla fosforilazione di γ-H2AX sia in studi in vitro che istologici [19]. Nonostante le gravi conseguenze causate dalla MC, che sono efficacemente prevenute mediante l’eliminazione del glutine dalla dieta, come già affermato, i marcatori di stress ossidativo e infiammazione possono persistere nei pazienti celiaci [15,20,21].
Studi precedenti effettuati dal nostro gruppo di ricerca hanno sostenuto il potenziale valore di composti antiossidanti provenienti da alimenti senza glutine, come i cereali pigmentati, per comporre diete sane dedicate alle persone celiache [22,23].
Di conseguenza, con questo lavoro abbiamo voluto confrontare l’effetto biologico di glucorafanina e sulforafano in un modello di epitelio intestinale umano (cellule CaCo-2), sottoposto a stress da gliadina e citochine pro-infiammatorie coinvolte nelle malattie autoimmuni, con l’obiettivo di valutare se le verdure crucifere possano essere razionalmente incluse nelle diete prive di glutine grazie al loro contenuto di glucosinolati.
La metodologia adottata nello studio è stata progettata per valutare in modo completo l’attività biologica della glucorafanina e del sulforafano su modelli cellulari intestinali, replicando le condizioni infiammatorie e ossidative rilevanti per la celiachia. Tutti i materiali e reagenti sono stati selezionati per garantire la riproducibilità e l’affidabilità degli esperimenti.
Effetto della glucorafanina e del sulforafano sui markers infiammatori e ossidativi nelle cellule CaCo-2
Nei precedenti lavori del nostro gruppo di ricerca [22,23], abbiamo osservato che l’aggiunta di gliadina digerita (1 mg/mL) a IL-1β e IFN-γ (10 ng/mL) aumentava il rilascio delle chemochine IL-8, CXCL-10 e MCP-1 da parte delle cellule CaCo-2. Pertanto, all’inizio di questo studio è stato applicato lo stesso protocollo sperimentale per confrontare l’attività biologica di glucorafanina e sulforafano.
Il sulforafano ha inibito il rilascio di tutte le chemochine selezionate a concentrazioni inferiori a 50 μM (Figura 1A, 1B, 1C). Al contrario, la glucorafanina non ha mostrato alcun effetto inibitorio a 50 μM. L’effetto inibitorio del sulforafano si è dimostrato concentrazione-dipendente, risultando più marcato contro il rilascio di MCP-1 (IC50 di 7.81 μM). La vitalità cellulare non è stata significativamente alterata dalle molecole in studio (Figura 2).
Il processo infiammatorio è stato associato a stress ossidativo e danno al DNA in campioni intestinali di pazienti celiaci [15,19-21]. Uno studio ha suggerito che la stessa gliadina digerita (500 μg/mL) possa indurre un lieve aumento della produzione di ROS e della fosforilazione dell’istone γ-H2AX (ser 139) nelle cellule CaCo-2, essendo quest’ultimo un marker ben riconosciuto di genotossicità [19].
Nel nostro modello sperimentale, si possono attribuire solo effetti irrilevanti alla gliadina digerita (1 mg/mL) tramite la valutazione dei markers ossidativi (γ-H2AX, ROS) durante 24 h di trattamento. Per questo motivo, i successivi esperimenti sono stati condotti utilizzando perossido di idrogeno (H2O2) per riprodurre un contesto pro-ossidante e genotossico.
La fosforilazione di γ-H2AX è stata quindi selezionata come marker precoce di danno al DNA (1 h), mentre le attività di Nrf-2 e catalasi sono state selezionate come indicatori dello stress ossidativo (6 h). Nrf-2 è un fattore di trascrizione che regola l’espressione di numerosi geni coinvolti nella risposta antiossidante e citoprotettiva, mentre la catalasi è un enzima che svolge un ruolo basilare nella protezione dai ROS, in particolare da H2O2. In parallelo, la capacità scavenger diretta dei composti è stata valutata tramite sistemi cell-free, come i saggi DPPH e FRAP.
Né il sulforafano né la glucorafanina (25 μM) hanno alterato la fosforilazione di γ-H2AX indotta da H2O2, che ha causato un chiaro aumento del numero di foci nucleari (accumuli visibili di proteine o complessi proteina-DNA all’interno del nucleo), come atteso. Il resveratrolo 20 μM, selezionato come composto antiossidante di riferimento per tutti gli esperimenti relativi allo stress ossidativo, ha causato un ulteriore aumento della fosforilazione di γ-H2AX: questa osservazione probabilmente riflette un potenziamento dei sistemi di riparazione del DNA e dei segnali apoptotici, considerato un fattore positivo contro la progressione tumorale [30]. Un’indicazione ulteriore è stata ottenuta utilizzando uno scavenger diretto come l’ascorbato (100 μM), che ha mostrato risultati identici al resveratrolo nei nostri set sperimentali.
In linea con questi dati, i composti solforati non hanno mostrato potere scavenger nei saggi redox DPPH e FRAP alla concentrazione di 200 μM, in confronto al resveratrolo 100 μM.
Durante il danno ossidativo, la fosforilazione di γ-H2AX è necessaria per attivare non solo le vie responsabili della riparazione del DNA, ma anche le difese antiossidanti in cui è coinvolto Nrf-2 [31]. Pertanto, l’attività trascrizionale di Nrf-2 è stata misurata in correlazione ai livelli di catalasi, per delineare un quadro più completo delle potenziali proprietà antiossidanti dei composti solforati.
H2O2 (1 mM) ha causato una diminuzione, anche se contenuta, sia dell’attività di Nrf-2 sia di quella della catalasi, sebbene significativa solo per la prima. Dati simili sono stati ottenuti da altri autori in cellule HepG2 (linea cellulare di carcinoma epatico) trattate con H2O2 1 mM [32]. Sorprendentemente, il sulforafano ha ulteriormente ridotto l’attività di Nrf-2 in maniera concentrazione-dipendente, mentre la glucorafanina ha mostrato un effetto opposto (Figura 3A). Anche in questo caso, il resveratrolo, usato come antiossidante di riferimento a concentrazione comparabile (20 μM), ha aumentato l’attività di Nrf-2 di oltre due volte rispetto a H2O2. Questa osservazione non si è riflessa in una modulazione rilevante della catalasi, poiché né l’attività enzimatica (Figura 3B), né l’espressione genica (Figura 4) sono state significativamente alterate da H2O2 o dai composti solforati. Da notare che lo stesso effetto è stato osservato dopo trattamento delle cellule con resveratrolo…