* Daniela Giorgetti
** Morena Gabriele
** Laura Pucci
Sostanza naturale di origine vegetale contenuta in numerosi frutti e verdure, la quercetina è particolarmente studiata per l’ampio ventaglio di attività biologiche, in particolare per le sue proprietà antiossidanti, antinfiammatorie e immunostimolanti, utili nella prevenzione di diversi disturbi e malattie.
Nell’organismo avvengono di continuo reazioni chimiche attraverso le quali i nutrienti sono metabolizzati per ottenere molecole essenziali, al fine di garantire la crescita e il corretto svolgimento di tutte le funzioni vitali. Tra i composti di scarto di queste attività metaboliche, sono di particolare rilievo i radicali liberi, composti estremamente instabili e reattivi poiché contengono almeno un elettrone spaiato nel loro orbitale più esterno. Tali molecole non sempre risultano dannose; talvolta possono svolgere un ruolo importante nel sistema delle difese dell’organismo, che le utilizza per combattere elementi patogeni quali batteri e virus. Non solo, possono stimolare il sistema immunitario. La funzione benefica però si esplica se viene mantenuto un corretto equilibrio tra i radicali liberi e gli antiossidanti che stabilizzano queste molecole altamente reattive [1].
In ambito clinico, gli studi dimostrano che numerose patologie di carattere infiammatorio e degenerativo sono caratterizzate da una rottura dell’equilibrio fisiologico tra la produzione e l’eliminazione di molecole ossidanti, che determina uno stato di stress ossidativo [2, 3].
Il nostro organismo tende a neutralizzare i radicali liberi sia attraverso un sistema antiossidante endogeno, costituito da enzimi come la catalasi, la superossido dismutasi e molecole come il glutatione ridotto, sia attraverso sostanze esogene, ossia assunte dall’esterno, che contengono molecole bioattive con proprietà antiossidanti, tra le quali i polifenoli e le vitamine.
Seguire un’alimentazione equilibrata e ricca di alimenti di origine vegetale, può essere sufficiente per ricevere il giusto apporto di sostanze con proprietà antiossidanti. Tuttavia, in particolari situazioni di rischio o in presenza di patologie conclamate in cui si riscontra un insufficiente apporto di sostanze antiossidanti per combattere gli effetti negativi dei radicali liberi, risulta indicato ricorrere all’assunzione di integratori ad azione antiossidante. Questi rappresentano per lo più formulazioni ottenute dalla combinazione di molecole bioattive presenti in natura, estratte o ottenute per sintesi e, a oggi, risultano efficaci per il trattamento di varie patologie [4, 5]. D’altro lato, l’assunzione di elevate dosi di antiossidanti può presentare dei rischi per la salute. I composti liposolubili come la vitamina E e il betacarotene, per esempio, possono causare tossicità per la loro capacità di accumularsi nel fegato e in altri tessuti, mentre un eccesso di vitamina C ha mostrato indurre apoptosi cellulare riconducibile a un’attività pro-ossidante [6].
È pertanto importante valutare la reale necessità di utilizzare integratori a base di antiossidanti, in funzione dello stato fisiopatologico di ciascun individuo.
Sebbene la biodisponibilità di questi composti rappresenti un problema che ancora non ha trovato una risposta univoca, studi epidemiologici, hanno evidenziato che all’aumento del consumo di polifenoli, si associa una riduzione dell’incidenza e della progressione di malattie cardiovascolari, neoplastiche, ostruttive polmonari e neurodegenerative, suggerendo che gli effetti benefici siano da attribuirsi alla capacità dei polifenoli di combattere l’insulto ossidativo che le caratterizza [7-9].
In questo contesto, le nostre analisi si sono focalizzate su quattro integratori a base di polifenoli, utilizzati principalmente in ambito oculistico, per rallentare la progressione di malattie degenerative della retina che hanno come esito un importante calo dell’acuità visiva e nei casi più gravi, la cecità.
È accertato infatti il ruolo dei polifenoli nella protezione della retina dalla neurodegenerazione e nel mantenimento dell’integrità dei capillari sanguigni, favorendo la circolazione e la corretta irrorazione dei tessuti [10].
Gli integratori, oggetto del nostro studio, sono costituiti da diverse miscele di principi attivi di origine vegetale, in particolare flavonoidi, una classe di polifenoli con proprietà antiossidanti che possono agire in maniera sinergica. Contengono tutti la quercetina, un flavonolo appartenente alla classe dei flavonoidi, oggi particolarmente studiato in quanto in grado di esercitare diversi effetti biologici: prevenire il danno delle cellule del miocardio proteggendo il cuore da eventi di disfunzione cardiaca, prevenire l’insorgenza o rallentare il decorso di malattie neurodegenerative, ridurre la tossicità di sostanze farmacologiche, migliorare la fibrosi polmonare e il danno polmonare acuto, prevenire il diabete di tipo II e ridurre i disturbi osteoarticolari [11-13].
Evidenze sperimentali in vivo e in vitro hanno dimostrato che la quercetina possiede anche proprietà antinfiammatorie e immunostimolanti: interagendo con enzimi e proteine di membrana, inibisce la produzione di citochine pro-infiammatorie (IL-1 e IL-6) e del fattore di necrosi tumorale (TNF-alfa), da parte dei macrofagi e delle cellule del sistema immunitario (Th-1 e Th-2) [14].
Oltre alla quercetina, estratti di piante medicinali e sostanze bioattive quali vitamina C ed E, acido alfa-lipoico, bromelina, esperidina e rutina sono contenuti negli integratori da noi valutati e di seguito descritti in dettaglio.
Nevrase Plus (di seguito indicato come Integratore A)
Nell’integratore in questione, la biodisponibilità di quercetina è garantita dalla sinergia con la vitamina C ed E che, come noto in letteratura, ne favoriscono l’assorbimento e ne inducono un’eccellente attività antiossidante [15]. L’attività di questi antiossidanti è potenziata dall’acido alfa-lipoico, un acido organico le cui proprietà antiossidanti sono dovute alla presenza del ponte disolfuro che si comporta come accettore di elettroni. Insieme alla quercetina, l’acido alfa-lipoico, protegge e favorisce la funzionalità nervosa, migliorando la velocità di conduzione e il flusso ematico endoneuronale; è in grado infatti di ripristinare in breve tempo l’integrità dei vasi sanguigni, utili al rifornimento di ossigeno e nutrienti alle fibre nervose e alle cellule retiniche favorendo la rimozione dei prodotti metabolici di scarto [16, 17].
Lucyvet (di seguito indicato come Integratore B)
La quercetina è presente in un’ampia varietà di piante medicinali tra cui il biancospino, il meliloto e il ginkgo biloba presenti in questo integratore. Il biancospino è una pianta spontanea le cui foglie e fiori sono ricchi di flavonoidi tra i quali la quercetina, la rutina, la luteolina, la vitexina, l’iperoside, l’apigenina, sostanze note per le loro proprietà antiossidanti. La frazione di biancospino contenuta nell’integratore è a elevato contenuto in iperoside avente effetto inotropo positivo, in grado cioè di migliorare la forza contrattile del muscolo cardiaco [18].
Il meliloto, pianta medicinale le cui sommità fiorite e le foglie contengono soprattutto cumarine e flavonoidi (kaempferolo e quercetina), ha dimostrato proprietà antiedematose utili nel trattamento dell’insufficienza venosa, permettendo un migliore drenaggio linfatico [19].
Anche il ginkgo biloba è utilizzato in fitoterapia, grazie alla presenza nelle foglie di glucosidi flavonoidici, tra cui la quercetina e di derivati terpenici, in particolare il ginkgolide B, ritenuto un efficace antagonista del PAF (fattore antiaggregante piastrinico), in grado di rendere il sangue più fluido e facilitarne il trasporto all’interno dei vasi e delle arteriole [20, 21].
Quercetene Forte (di seguito indicato come Integratore C)
Nella composizione relativa a questa miscela, l’effetto antinfiammatorio della quercetina è potenziato grazie alla presenza di Ananas comosus, un frutto tropicale appartenente alla famiglia delle Bromeliaceae. Il principio attivo responsabile dell’azione biologica è la bromelina, un insieme di enzimi proteolitici, in grado di modulare l’espressione genica di fattori coinvolti nell’attivazione e nel mantenimento di processi infiammatori e ossidativi [22]. La combinazione tra bromelina e quercetina è utile anche per il trattamento di allergie, che come qualsiasi processo infiammatorio, sono caratterizzate da un’eccessiva produzione di istamina. Una caratteristica peculiare della quercetina è appunto quella di impedire la degranulazione dei mastociti contrastando il rilascio di istamina e di agire sugli stessi recettori del cortisone, senza produrre i noti effetti collaterali legati all’uso prolungato di corticosteroidi [23].
Endotel (di seguito indicato come Integratore D)
Oltre alla quercetina e alla vitamina C, altre sostanze bioattive dalle note proprietà antiossidanti che caratterizzano questo integratore sono la rutina e l’esperidina.
La rutina è un glicoside flavonoico che nella sua struttura contiene la molecola della quercetina insieme a una parte zuccherina, il rutinosio. La sua funzione come antiossidante si esplica attraverso la capacità di legarsi al ferro bivalente(Fe2+2+) prevenendone il legame con il perossido di idrogeno (H2O2), reazione che genererebbe radicali liberi altamente reattivi [24].
L’esperidina, presente soprattutto nella buccia degli agrumi, è un bioflavonoide noto per i suoi effetti capillarotropici: è in grado cioè di ridurre la permeabilità e la fragilità delle pareti capillari, aumentandone la resistenza. Così come gli altri flavonoidi, l’esperidina vanta un’eccellente attività antiossidante e antinfiammatoria [25].
Obiettivo del nostro studio è stato sia caratterizzare queste formulazioni per il loro contenuto totale di polifenoli sia determinare la loro attività antiossidante in vitro ed ex vivo su un sistema cellulare rappresentato da eritrociti umani.
MATERIALI E METODI
Contenuto dei polifenoli totali
Sugli estratti acquosi ottenuti sciogliendo la dose giornaliera, corrispondente a 2 cpr per l’Integratore D e 1 cpr per gli altri integratori, in 10 mL di acqua, sono stati determinati i polifenoli totali con il metodo di Folin-Ciocalteu in accordo a quanto riportato da Singleton e collaboratori [26]. Brevemente, l’estratto di ciascuna formulazione è stato miscelato con il reattivo di Folin-Ciocalteu 0.2 N e incubato al buio per 5 minuti. Quindi è stato aggiunto carbonato di sodio (Na2CO3) 0.7 M e dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente, al buio, è stata misurata l’assorbanza a 760 nm. Il contenuto totale di polifenoli è stato espresso come mg di acido gallico equivalenti per dose giornaliera di integratore (mg GAE/dose giornaliera).
Dosaggio DPPH
L’attività antiossidante in vitro delle 4 formulazioni è stata valutata mediante saggio DPPH (2,2-difenil-1-picrylhydrazyl) [27]. A concentrazioni crescenti di estratto è stata aggiunta una soluzione metanolica di DPPH. Dopo 30 minuti di agitazione al buio, l’assorbanza è stata registrata a 517 nm e l’attività antiradicalica (ARA) è stata determinata utilizzando la seguente equazione: ARA = [1 – (AS / ADPPH)] × 100, dove AS è l’assorbanza del campione e ADPPH è l’assorbanza della soluzione DPPH. La concentrazione dell’estratto corrispondente al 50% dell’inibizione dei radicali DPPH (EC500) è stata calcolata come descritto da Gabriele e collaboratori [28].
Attività antiossidante cellulare nei globuli rossi (CAA-RBC: Cellular Antioxidant Activity-Red Blood Cells)
I campioni di sangue sono stati raccolti in provette trattate con l’anticoagulante EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) e centrifugati per rimuovere il plasma, le piastrine e il buffy coat. Gli eritrociti sono stati diluiti in PBS e sono stati incubati 1 ora a 37 °C in agitazione al buio, con la sonda DCFH-DA (2’,7’-diclorofluoresceina diacetato), gli estratti o lo standard costituito dalla quercetina. Al termine dell’incubazione, gli eritrociti sono stati lavati per rimuovere l’eccesso di antiossidanti e risospesi in PBS freddo. Alla sospensione cellulare è stato quindi aggiunto un generatore di radicali liberi, l’AAPH (2,2′-azobis2-amidinopropano), che causa l’ossidazione e la modificazione della DCFH nel derivato fluorescente DCF. La fluorescenza è stata misurata mediante fluorimetro Perkin-Elmer Victor X3 (Waltham, MA) alla λex485 nm e λem520 nm. Al termine delle letture, ripetute per 12 cicli, la fluorescenza prodotta è stata misurata integrando l’area sotto la curva. I dati relativi all’attività antiossidante sono stati espressi come unità CAA, secondo la seguente formula: unità CAA= 100 – (∫SA / ∫CA) × 100; dove ∫SA rappresenta l’area integrata della curva di fluorescenza del campione, mentre ∫CA è il controllo [29]. I campioni sono stati diluiti 1:100 e 1:1000.
RISULTATI
L’analisi dei polifenoli totali mostra un contenuto nei 4 integratori che varia da un minimo di 4,33 a un massimo di 7,59mg GAE/dose giornaliera (Tabella 2).
Come si osserva in tabella 2, l’Integratore A presenta il più alto contenuto di polifenoli somministrati per dose giornaliera, seguito dall’Integratore D, dall’Integratore C e infine dall’Integratore B.
L’attività antiossidante in vitro dei quattro integratori è stata valutata mediante il saggio DPPH. I risultati sono stati espressi come EC50, ovvero la concentrazione di prodotto che causa una riduzione del 50% dei radicali DPPH.
Come si osserva nella tabella 2, il composto che si è dimostrato più efficace nel ridurre i radicali DPPH è l’Integratore C con valori di EC50 pari a 0,016 mg/mL, seguito dall’Integratore D, dall’Integratore A e dall’Integratore B. La miscela di composti bioattivi presenti nell’Integratore C risulta pertanto ottimale già alle più basse concentrazioni, mostrando una significativa azione antiradicalica.
In figura 1 è illustrato il risultato del test CAA-RBC eseguito su eritrociti umani esposti a condizioni ossidative dopo pretrattamento con ciascuno dei quattro integratori, a due diverse concentrazioni, o con lo standard rappresentato dalla quercetina. Il test CAA-RBC misura la capacità degli antiossidanti di inibire l’ossidazione di una sonda, la DCFH-DA, che diffondendo all’interno delle cellule viene deacetilata e convertita dalle esterasi intracellulari nel composto non fluorescente DCFH. In presenza di un generatore di radicali liberi come l’AAPH, la DCFH viene ossidata nel derivato fluorescente DCF. Pertanto, l’aggiunta di molecole con attività antiossidante al sistema, inattivando i radicali liberi generati, inibisce la produzione di DCF con una conseguente riduzione della fluorescenza emessa. La fluorescenza intracellulare prodotta è indice dell’attività antiossidante cellulare del composto. Una maggiore attività antiossidante del principio attivo si traduce in una riduzione della fluorescenza, inversamente proporzionale al valore dell’unità CAA.
Sebbene a concentrazioni più alte (diluizione 1:100) tutti gli integratori abbiano mostrato un’elevata attività antiossidante negli eritrociti, sovrapponibile a quanto ottenuto con lo standard, è stato osservato che a concentrazioni 10 volte inferiori (diluizione 1:1000) il composto D svolge un’azione antiossidante significativamente maggiore rispetto alle altre formulazioni (p<0.001).
I quattro integratori in oggetto risultano avere ottime proprietà antiossidanti, come atteso, grazie alla presenza di numerose molecole bioattive, principalmente polifenoli.
Dalle analisi da noi effettuate, l’Integratore A ha mostrato il più alto contenuto di polifenoli; l’Integratore C risulta l’integratore più efficace nell’azione antiradicalica determinata con il test del DPPH, mentre l’Integratore D, probabilmente ricco di composti particolarmente attivi e biodisponibili a livello cellulare, ha dato la miglior attività antiossidante nel sistema ex vivo di eritrociti umani da noi utilizzato.
In conclusione, l’integrazione dei suddetti prodotti nel trattamento di patologie croniche e degenerative caratterizzate da una condizione iniziale di notevole stress ossidativo, potrebbe rappresentare un valido alleato per potenziare le difese antiossidanti dell’organismo e coadiuvarne il trattamento.
La scelta del composto da impiegare dipenderà, al di là delle più o meno spiccate proprietà antiossidanti totali, anche dalle proprietà intrinseche delle diverse componenti, funzionali al trattamento di specifiche condizioni fisiopatologiche.
* Biologa Nutrizionista, specializzata in Biologia applicata alla Biomedicina
** Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria, CNR, Pisa
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