* Federica Medici
** Martina Bertocchi
Ascophyllum nodosum è un’alga bruna diffusa soprattutto nel bacino del Nord Atlantico. È ricca di alginati, clorofille, carotenoidi e fucoxantine. Alcune ricerche recenti hanno dimostrato le sue potenzialità nel ridurre il rischio di malattie cardiovascolari e nel contenere i livelli di insulina e colesterolo LDL. Lo studio preliminare che presentiamo è stato effettuato per valutare l’attività di questa alga rispetto alla salute del cavo orale nel cane.
Sin dall’antichità, i popoli che abitavano nelle zone costiere utilizzavano le alghe marine nell’alimentazione quotidiana, al pari di frutta e verdura. Molti documenti antichi riportano l’utilizzo di alghe nella cucina di Cinesi e Giapponesi, che considerano le alghe una importantissima fonte di nutrienti e di benessere. Questi vegetali marini, infatti, sono ricchissimi di molecole bioattive e principi nutritivi che hanno permesso un utilizzo delle alghe in diversi ambiti, inclusi quello agro-alimentare, farmaceutico, energetico, industriale e molti altri ancora (Stengel and Connan, 2015). Tuttavia, a seconda dell’ambiente in cui vivono, le alghe possono presentare anche elevate concentrazioni di inquinanti tossici per l’uomo e per gli animali tra i quali piombo, arsenico e cadmio (Biancarosa et al., 2018; Nakamura et al., 2008; Taylor and Jackson, 2016).
Alghe brune: classe Phaeophyceae
Le alghe brune, o Phaeophyceae, rappresentano un gruppo molto vasto di macroalghe classificate in più di 250 generi e oltre 1500 specie (Dawes, 1978). La maggior parte di queste alghe presenta un tallo di tipo filamentoso o parenchimatoso, con dimensioni molto variabili, che possono raggiungere anche diverse decine di metri (Lee, 2008; Pasqua et al., 2015).
Le Phaeophyceae sono alghe marine e rappresentano una componente intertidale importante che si estende dalla zona litorale superiore alla zona sublitorale, fino a raggiungere in alcuni casi una profondità di 220 metri nelle limpide acque tropicali. Le caratteristiche di illuminazione e trasparenza delle acque determinano una stratificazione verticale degli organismi vegetali e animali. In particolare, nella colonna d’acqua, le alghe brune si trovano a profondità elevate, da 100 a 200 metri, poiché sono in grado di assorbire una radiazione luminosa blu-verde che riesce a penetrare più in profondità rispetto a radiazioni con lunghezze d’onda maggiori, come quelle rosso-arancio.
Le Phaeophyceae presentano cellule dotate di una parete cellulare complessa: la componente fibrillare è costituita principalmente da cellulosa (2-20%), mentre la matrice è composta da fucoidani e alginati. I cloroplasti possono essere più o meno numerosi, con forme diverse e possono contenere uno o più pirenoidi (corpi densi con funzione di riserva) (Pasqua et al., 2015). I pigmenti fotosintetici contenuti nei cloroplasti sono: clorofilla a, clorofille c1 e c2 (tipiche di alghe brune, diatomee e dinoflagellate), beta-carotene e altri carotenoidi contenenti atomi di ossigeno, come le xantofille. La più importante xantofilla presente in queste alghe brune è la fucoxantina (Fig.1) che determina il colore del tallo; altre xantofille sono la violaxantina e la zeaxantina. La fucoxantina contenuta nei cloroplasti delle alghe brune, si è rivelata attiva contro l’obesità, il diabete e l’infiammazione, inoltre svolge un ruolo importante come antiossidante (Seo et al., 2016; Zeng et al., 2018).
Spesso nelle cellule sono presenti numerose vescicole incolori, chiamate fisòdi che contengono florotannini (1-15%), la cui ossidazione determina il colore dei talli in decomposizione. Inoltre, questi tannini hanno un importante ruolo di difesa (Lee, 2008; Pasqua et al., 2015). Le sostanze di riserva principali sono la laminarina (o laminarano), un polisaccaride che si accumula nei vacuoli e il D-mannitolo, la cui concentrazione può variare in funzione della salinità (Lee, 2008; Raven et al., 2002).
Molte specie di Phaeophyceae concentrano lo iodio (fino allo 0,3% del peso fresco) e il bromo in apposite cellule; inoltre, alcune alghe brune rilasciano nell’ambiente grandi quantità di metano brominato che costituisce un deterrente per gli animali erbivori e inibisce la crescita di organismi epifiti (Pasqua et al., 2015).
I diversi composti chimici caratteristici di questo gruppo algale sono riportati nella tabella 1.
Ascophyllum nodosum
Ascophyllum nodosum (L.) Le Jolis, è un’alga bruna della famiglia delle Fucaceae, unica specie del genere Ascophyllum. Si trova principalmente nel bacino del Nord Atlantico, dove domina le zone intertidali rocciose e può essere facilmente raccolta (Kadam et al., 2017). In particolare è presente lungo le coste dell’Europa nordoccidentale, nell’Est della Groenlandia e sulle coste orientali del Nord America.
Da un punto di vista morfologico, A. nodosum presenta lunghe fronde provviste di vescicole vuote distribuite a intervalli regolari. Le fronde possono raggiungere i 2 metri di lunghezza e sono collegate da un peduncolo alle rocce e ai massi della costa (Hiscock, 1979) (Fig.2).
A differenza delle altre specie appartenenti alle Fucaceae, che vivono in media 2-3 anni, A. nodosum può vivere fino a 12-15 anni a seconda della posizione che occupa lungo il litorale. Nonostante la sua longevità, Ascophyllum produce una scarsa quantità di sporangi, di conseguenza, impiega circa un paio di decenni per ripopolare un’area spoglia. Questo fatto ha determinato un grave impoverimento delle popolazioni di Ascophyllum nelle zone in cui quest’alga è ampiamente sfruttata commercialmente (Lee, 2008).
Grazie alle sue peculiari proprietà, infatti, viene impiegata in diversi ambiti commerciali, da quello agro-alimentare a quello farmaceutico ed è molto conosciuta nella comunità scientifica perché oggetto di molti studi (Combet et al., 2014; Goñi et al., 2016).
A. nodosum contiene molte interessanti molecole bioattive (Blunden et al., 2010). In particolare la presenza di alginati, insieme a clorofille, carotenoidi, fucoxantine e altre molecole antiossidanti, rende A. nodosum un buon candidato per favorire l’eliminazione di tossine e proteggere le cellule dagli effetti tossici di metalli pesanti e additivi chimici (Villares et al., 2017). A. nodosum contiene inoltre iodio, aminoacidi, vitamine (vitamina C, betacarotene, vitamina E, vitamine del gruppo B) e minerali (calcio, potassio, magnesio e selenio) (Kadam et al., 2015). Quest’alga svolge un’importante attività come prebiotico sulla flora batterica intestinale, grazie alla presenza di alginati e mannitolo, che proteggono inoltre le mucose intestinali e garantiscono un buon equilibrio acido-basico (Nagaoka et al., 2000; O’Sullivan et al., 2010). Nonostante l’elevata tollerabilità e l’assenza di reazioni allergiche nei consumatori, le alte concentrazioni di iodio rendono quest’alga controindicata in soggetti affetti da ipertiroidismo (Combet et al., 2014).
Studi recenti hanno dimostrato le potenzialità di queste alghe nel ridurre il rischio di malattie cardiovascolari e nel contenere i livelli di insulina, colesterolo LDL e pressione (Paxman et al., 2008). Altri ambiti di applicazione di quest’alga sono quello agricolo, per il miglioramento del metabolismo delle piante (Goñi et al., 2016; Shukla et al., 2018) e quello zootecnico come supplemento alla dieta degli animali da allevamento (Chaves Lopez et al., 2016).
Caratterizzazione biochimica di Ascophyllum nodosum
Il grande interesse nei confronti di A. nodosum e della ricchezza di molecole attive che esso contiene e la grande variabilità che caratterizza i preparati di origine naturale, ci ha spinti verso uno studio più approfondito di A. nodosum, in particolare focalizzato sulla composizione biochimica di alcuni campioni commerciali di quest’alga bruna. La caratterizzazione è stata condotta mediante determinazione di 19 elementi traccia essenziali e tossici (in collaborazione con l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, sede di Bologna), l’estrazione delle proteine citosoliche, seguita da separazione in cromatografia a esclusione molecolare.
I quattro campioni commerciali di A. nodosum utilizzanti in questo studio presentavano una colorazione e una consistenza che li rendeva molto differenti l’uno dall’altro e anche l’odore era più o meno intenso. In tutti i campioni di Ascophyllum, tra gli elementi essenziali per l’organismo, il Fe presentava concentrazioni più elevate con valori > 200 mg/kg, anche se si ipotizza una scarsa biodisponibilità, poiché dalle analisi mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico sulle frazioni cromatografiche ottenute dopo gelfiltrazione, il Fe risultava scarsamente legato a proteine e amminoacidi. Come già ricordato precedentemente, le macroalghe sono in grado di accumulare nel loro tallo metalli tossici, tra questi suscita particolare preoccupazione l’arsenico, che in tutti i campioni era presente con una concentrazione > 17 mg/kg. In generale le macroalghe contengono alte concentrazioni di questo elemento, anche se prevalentemente in forma organica, considerata meno tossica di quella inorganica (Caumette et al., 2012). La tossicità dell’arsenico dipende infatti dalla sua speciazione. Le alghe assumono l’arsenico in forma inorganica (iAs) dall’acqua e lo accumulano come arsenozuccheri (Taylor and Jackson, 2016). Sono necessarie ulteriori ricerche per approfondire questo aspetto di particolare importanza per la sicurezza dei consumatori. Dalle analisi in spettrofotometria UV sulle frazioni cromatografiche abbiamo potuto osservare un’elevata concentrazione di proteine citosoliche e amminoacidi liberi, tra questi di particolare interesse sono i cosiddetti amminoacidi micosporinici (MAAs) (Fig.3), metaboliti secondari prodotti da alcuni organismi acquatici, incluse le alghe, per proteggersi dai raggi ultravioletti (Chrapusta et al., 2017; Lawrence et al., 2017).
Studio in vivo: valutazione dell’attività di un prodotto commerciale a base di A. nodosum sulla salute del cavo orale
Negli ultimi anni, quest’alga ha trovato impiego nell’ambito della Medicina Veterinaria in quanto utilizzata nell’igiene orale come presidio contro la formazione della placca e per migliorare l’alitosi negli animali da compagnia, come il cane e il gatto (Gawor and Jodkowska, 2013). Per questo motivo, la parte in vivo del nostro studio, si è concentrata sulla valutazione dell’effetto di A. nodosum sulla composizione chimica della saliva in relazione all’alitosi e alla formazione di placca in sei cani.
Oltre il 70% dei cani, dopo i primi anni di vita, soffre di patologie del cavo orale, molte delle quali sono causate da una scarsa igiene orale e quindi dall’accumulo di placca e tartaro. Non tutti i cani sono colpiti in egual misura: infatti, come nell’uomo, esiste una predisposizione individuale a sviluppare queste patologie; inoltre è stata evidenziata una predisposizione legata alla razza e alla taglia: infatti quelli più colpiti sono i cani di piccola taglia o “toy” (Squarzoni, 2003). In particolare, la placca è costituita da una matrice glicoproteica in cui sono presenti più di 300 tipi di batteri diversi (Dewhirst et al., 2012; Holcombe et al., 2014). Se la placca non viene rimossa dalla superficie dentale per più di dieci giorni, i minerali presenti nella saliva possono essere incorporati nella placca andando a formare il tartaro che deriva dalla mineralizzazione della placca in seguito al deposito di sali di calcio e fosforo (Fig.4) (Lobprise, 2000; Squarzoni, 2003).
La colonizzazione batterica provoca un’infiammazione di tipo essudativo, inizialmente limitata al solco gengivale (gengivite). Escludendo condizioni complesse, la gengivite è una patologia reversibile, ma se non viene trattata tempestivamente può evolvere in parodontite, a causa della migrazione dei batteri dal solco gengivale verso l’apice. Le malattie parodontali, a differenza delle gengiviti sono irreversibili, possono compromettere tutte le strutture di sostegno dei dentigenerando forte dolore, fino alla perdita del dente stesso, possono creare difficoltà nel masticare il cibo e possono infine indurre una grave alitosi (Fig.5) (Culham and Rawlings, 1998). Nella maggior parte dei casi, un cattivo odore dell’alito può indicare un processo patologico in atto nel cavo orale, oppure può derivare da disordini gastrointestinali o malattie sistemiche come infezioni respiratorie, diabete e insufficienza renale (Eubanks, 2006). I batteri anaerobi Gram-negativi (Bacterioides spp., Porphyromonas spp., Prevotella spp., Fusobacterium) (Allaker et al., 1997) sono i principali microrganismi coinvolti nella patogenesi della parodontite e sono i responsabili della forte alitosi, poiché producono composti volatili dello zolfo (VSC), come l’idrogeno solforato e il metilmercaptano.
Nello studio sono stati inclusi sei soggetti, selezionati escludendo patologie del cavo orale, patologie di altra origine, soggetti sottoposti a cure farmacologiche e femmine gravide o in lattazione. Prima dell’inizio del trattamento (T0) i soggetti sono stati sottoposti a una visita odontostomatologica generale, presso il Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie dell’Università di Bologna, a una anamnesi da parte del proprietario mediante questionari e a un prelievo salivare con tamponi Salivette.
I soggetti sono stati trattati per 33 giorni con capsule di gelatina alimentare contenente A. nodosum con un dosaggio di 150 mg/10kg/die, somministrate durante il pasto del mattino.
Al termine del trattamento (T1) è stata fatta una seconda visita specialistica per valutare eventuali miglioramenti a livello del cavo orale, una valutazione soggettiva da parte del proprietario e un prelievo salivare mediante tampone Salivette (Fig.6). Sui campioni di saliva prelevati prima e dopo il periodo di trattamento, sono state analizzate le proteine salivari mediante elettroforesi SDS-PAGE.
Dalla prima visita odontostomatologica è emerso che tutti i soggetti erano affetti da una forma di gengivite più o meno importante, che si è risolta dopo la somministrazione del fitoterapico, tranne in un solo caso. In particolare, nel soggetto che presentava un quadro infiammatorio più grave (edema gengivale diffuso) si sono riscontrati i miglioramenti più evidenti, con scomparsa dell’edema. Tra le diverse attività di A. nodosum, infatti, viene riportata anche attività antinfiammatoria riconducibile a diversi composti in essa contenuti (florotannini, fucoidani) come riportato in diversi studi recenti (Cumashi et al., 2007; Dutot et al., 2012). In un unico soggetto non ci sono stati miglioramenti dell’infiammazione gengivale; questo risultato potrebbe essere collegato alla sospensione delle pratiche di igiene orale con spazzolino e dentifricio a uso veterinario durante il periodo di trattamento, confermando così l’importanza della pulizia dei denti costante come prevenzione delle patologie del cavo orale (Squarzoni, 2003).
In tutti gli altri cani affetti da alitosi è stato riscontrato un miglioramento in seguito al trattamento con A. nodosum; questo miglioramento potrebbe essere ricondotto sia a un effetto positivo sul microbiota intestinale sia a un’attività indiretta sulla produzione delle ghiandole salivari.
Uno dei sei cani coinvolti nello studio ha mostrato un miglioramento a carico della funzionalità intestinale con riduzione della flatulenza e scomparsa delle scariche diarroiche. Alcuni studi, infatti, hanno evidenziato la capacità di A. nodosum di influenzare il microbiota intestinale, con meccanismi ancora non chiariti (Chen et al., 2018; Zhou et al., 2018), ma probabilmente riconducibili alla sua attività prebiotica.
Il principale responsabile dell’attività antibatterica della saliva è il lisozima (Derde et al., 2017), un enzima presente in numerose secrezioni animali e umane come le lacrime e la saliva, che catalizza l’idrolisi del legame tra l’acido N-acetilmuramico e la N-acetilglucosamina del peptidoglicano presente nella parete dei batteri Gram +. Dalle analisi delle proteine salivari mediante elettroforesi SDS-PAGE, abbiamo potuto osservare in tutti i soggetti dopo il trattamento una riduzione nel numero e nell’intensità di molte bande proteiche e in particolare, della banda che, in base al peso molecolare, potrebbe essere identificata come lisozima. Questo risultato è a favore di una potenziale attività antibatterica di A. nodosum (Mahltig et al., 2013; Tamanai-Shacoori et al., 2014) che, andando a diminuire la carica batterica totale del cavo orale, potrebbe determinare, di conseguenza, una riduzione di questo enzima.
Le prospettive future
I dati riportati in questo studio preliminare mettono in evidenza la ricchezza di proteine ed elementi traccia in A. nodosum. In futuro, saranno necessari ulteriori approfondimenti per quanto riguarda la concentrazione e la biodisponibilità degli elementi essenziali e di quelli non essenziali, potenzialmente tossici per la salute umana e animale. Grazie ai risultati ottenuti dalla prova in vivo possiamo confermare l’attività dell’alga bruna A. nodosum nel trattamento dei disturbi del cavo orale nel cane; è però importante puntualizzare che questa integrazione deve essere considerata complementare all’igiene orale quotidiana, che a oggi rimane il più importante ed efficace metodo di prevenzione delle patologie orali. Inoltre si potrebbe pensare di formulare una pasta o gel per l’igiene del cavo orale contenente A. nodosum per valutarne un’efficacia topica. Verificata la biodisponibilità dei più importanti elementi essenziali e la speciazione dell’arsenico, quest’alga potrebbe essere impiegata non solo negli animali da compagnia, ma anche in altri settori della medicina veterinaria, come supplemento dietetico negli animali da allevamento (Dove and Haydon, 1991; Langenmayer et al., 2018; Sorge et al., 2016).
Ringraziamenti
Si ringraziano la Dott.ssa Emma Bellei, per aver effettuato le visite odontostomatologiche ai cani, il Dott. Maurizio Scozzoli per aver fornito il campione di A. nodosum utilizzato nella prova in vivo sui cani e la Dott.ssa Teresa Cerchiara per la preparazione delle capsule a base di A. nodosum.
Il presente articolo rielabora la tesi del master di I livello in Fondamenti di Fitoterapia di Federica Medici (Relatore Prof.ssa Gloria Isani). Le ricerche sono state svolte presso il Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie dell’Università di Bologna
*Biologa, Master in Fitoterapia
**Biotecnologa, Dottoranda in Scienze Veterinarie
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