*Beatrice Zuffada,
**Cinzia Boselli,
**Francesco Saverio Robustelli della Cuna
La ricerca scientifica è focalizzata sullo studio dei molteplici meccanismi d’azione del gossipolo, una molecola estratta dalle piante del genere Gossypium, che insieme ai suoi derivati ha dimostrato di possedere una notevole attività antitumorale. Sono numerosi gli studi sull’utilizzo di nanocarriers di varia natura che siano in grado trasportare questa molecola al suo sito bersaglio, controllandone la citotossicità senza alterare le proprietà antitumorali.
Il gossipolo, oltre a essere un promettente farmaco antitumorale, ha dimostrato di essere in grado di sensibilizzare le cellule verso altri approcci terapeutici attraverso i suoi effetti sinergici.
Sinergia con la chemioterapia tradizionale
Il carcinoma del colon è la quarta causa di morte correlata alle patologie tumorali a livello mondiale. Il 5-fluorouracile è uno degli agenti chemioterapici per il trattamento del tumore al colon. L’efficacia della terapia con 5-FU è, tuttavia, limitata a causa dell’insorgenza di resistenza. La timidilato sintasi (TS) è un enzima coinvolto nella sintesi di DNA ed è un target del 5-FU. Numerosi studi hanno dimostrato come il trattamento con 5-FU possa indurre l’espressione di TS esitando in chemioresistenza. Bassi livelli di TS, invece, sensibilizzano le cellule alla terapia con 5-FU. La timidina fosforilasi (TP) è un enzima chiave che contribuisce al processo metabolico dei nucleotidi pirimidinici. È noto che pazienti con elevati livelli di espressione di TP, trattati con 5-FU, hanno mostrato una prognosi molto più favorevole rispetto ad altri. La chinasi mTOR è un elemento chiave nella trasduzione del segnale intracellulare responsabile della regolazione della crescita e della proliferazione cellulare. Questa chinasi è in grado di fosforilare e attivare il p70S6K1, un mediatore della funzione di mTOR che contribuisce alla regolazione di numerose funzioni cellulari quali la sintesi proteica, la crescita e la sopravvivenza cellulare. L’inibizione della fosforilazione di p70S6K1 da parte di mTOR è in grado di sopprimere la proliferazione e la crescita delle cellule tumorali e di contribuire al superamento del fenomeno di resistenza verso le terapie farmacologiche. Yang et al. hanno studiato l’effetto della terapia combinata 5-FU/gossipolo nel trattamento del carcinoma del colon: il gossipolo è stato in grado di down regolare l’espressione di TS e di inibire l’espressione di TS indotta dal 5-FU. Al contrario non è stato in grado di influenzare a livello biochimico TS in quanto non interferisce con la formazione del complesso ternario tipico dell’attivazione di TS; non ha alterato l’espressione di TP. Tale alterazione dell’espressione di TS si verifica in quanto il gossipolo, somministrato da solo o in combinazione con 5-FU, è in grado di diminuire l’espressione della ciclina D1. Un altro meccanismo d’azione attraverso cui il Gossipolo esplica l’azione sinergica con 5-FU è dovuta alla riduzione della fosforilazione di mTOR e, di conseguenza, di p70S6K1. Gli effetti del gossipolo in combinazione con 5-FU sono stati studiati con saggi di proliferazione cellulare MTT, citometria a flusso e Western Blot, utilizzando le linee cellulari HT-29, HT-116 e RKO; è stata osservata un’aumentata sensibilità delle cellule tumorali vs 5-FU quando somministrato in associazione a gossipolo. Inoltre la proliferazione cellulare delle linee HT-29, HCT-116 e RKO risulta inibita quando incubate con 5-FU. Queste analisi combinate a saggi Western Blot dimostrano come il gossipolo in combinazione con 5-FU sia in grado di indurre l’attivazione della procaspasi 3 e la scissione di PARP nelle linee cellulari considerate. La gemcitabina è un analogo nucleotidico della deossicitidina comunemente utilizzato per il trattamento del carcinoma mammario, polmonare, pancreatico e ovarico. Il principio attivo penetra nelle cellule mediante un trasportatore specifico e viene sottoposto a fosforilazione intracellulare (deossicitidina chinasi) che lo converte nel metabolita attivo. Quest’ultimo è in grado di intercalarsi nel DNA e di inibire la sintesi e la proliferazione cellulare, promuovendo il processo apoptotico. La sovraespressione di proteine anti apoptotiche come Bcl-2 gioca un ruolo chiave nell’insorgenza delle resistenze nei confronti della gemcitabina. In questo scenario, il gossipolo sembra essere un importante tool terapeutico per evitare il fenomeno della resistenza. Wong et al. hanno dimostrato come la terapia combinata gossipolo/gemcitabina non porti a resistenza e migliori gli effetti della terapia farmacologica. Sono state impiegate 10 linee cellulari che hanno permesso di evidenziare come il sinergismo tra i principi attivi sia osservabile nelle cellule che presentano un’elevata espressione della proteina Bcl-2, ma non in quelle che presentano scarsi livelli di espressione della stessa. Per meglio definire i meccanismi alla base di questo sinergismo è stata presa in esame la modulazione delle proteine pro- e anti-apoptotiche nelle linee cellulari ad alta espressione di Bcl-2 (YCC616, CNE2 e MCF7). A seguito del trattamento con gemcitabina si può notare come le proteine anti apoptotiche (Bcl-2 e Bcl-XL) vengano up regolate; al contrario esse vengono down regolate dopo il trattamento con gossipolo. A questo si aggiunge che il gossipolo comporta una sovra espressione delle proteine pro apoptotiche Noxa e Mcl-1s. Quando utilizzati in combinazione, i due principi attivi portano ad un significativo abbassamento dei livelli delle proteine anti apoptotiche e a un aumento dell’espressione della proteina pro apoptotica Mcl-1s. Sulla scorta di queste osservazioni è possibile dedurre che il trattamento combinato gemcitabina/gossipolo permetta di bypassare il fenomeno della resistenza mediante un duplice meccanismo che prevede la down regolazione delle proteine anti apoptotiche e una up regolazione delle proteine pro apoptotiche [43].
Il fenomeno della radio-resistenza altera marcatamente l’efficacia della radioterapia antitumorale e coinvolge l’insorgenza di specifiche vie anti apoptotiche che proteggono la cellula dalla morte causata dalle radiazioni. È stata osservata una sovraespressione significativa della proteina Bcl-2 nel carcinoma prostatico refrattario alle terapie convenzionali, suggerendo che la ricorrenza localizzata di questa forma tumorale possa coinvolgere tale proteina. Anche la sovraespressione di Bcl-XL sembra coinvolta nella resistenza tumorale ed è associata ad una progressione di tale patologia, a una prognosi negativa e una diminuita sopravvivenza. L’inibizione delle funzioni anti apoptotiche di queste proteine, associata alla radioterapia, sembra costituire una nuova strategia terapeutica per superare il problema della resistenza alla terapia radiante. Dal momento che il gossipolo si è dimostrato un potente inibitore di tali proteine, esso è stato studiato in combinazione alla radioterapia per la cura del cancro alla prostata. Nello specifico in preparati cellulari di PC-3 il gossipolo è stato in grado di potenziare l’apoptosi indotta dalle radiazioni e la conseguente inibizione della crescita cellulare. Questa combinazione di meccanismi ha inoltre permesso di osservare un’importante regressione del tumore negli studi in vivo. Il gossipolo agisce tramite inibizione dell’espressione di Bcl-2 e Bcl-XL, determinando mancata inibizione dell’apoptosi cellulare unitamente al blocco dell’angiogenesi mediata da tali proteine [44]. Per meglio comprendere come il (-)-gossipolo possa sensibilizzare le cellule PC-3 alle radiazioni in vivo, sono stati condotti esperimenti su topi atimici xenotrapiantati con cellule PC-3 umane. Il (-)-gossipolo in combinazione con la terapia radiante determina la regressione tumorale nei modelli in vitro di tumore alla prostata PC-3. I dati dimostrano una variazione significativa della curva di crescita del tumore quando trattato solamente con raggi X rispetto al trattamento combinato con gossipolo. Inoltre, la terapia combinata non mostra una tossicità significativamente più marcata rispetto ai trattamenti singoli o rispetto al gruppo di controllo.
Utilizzo di nano carriers caricati con gossipolo
Gli effetti sinergici del gossipolo con altri agenti antitumorali portano a risultati promettenti, nonostante spesso vi siano problemi di farmacocinetica o di tossicità, per risolvere i quali sono stati sviluppati nanocarriers, che permettono il rilascio dei farmaci al sito d’azione. Nello specifico i nanocarriers possono essere utilizzati caricando gossipolo e altri principi attivi per veicolare differenti agenti alle cellule target. I materiali di costituzione dei nanocarriers devono sempre essere biocompatibili. Le prime nanoparticelle sono state preparate con olio di cotone arricchito in gossipolo. I liposomi, caratterizzati da un’ottima stabilità, hanno permesso di sopprimere la proliferazione cellulare in preparati di carcinoma mammario in vitro e nel modello MDA-MB-231. Dopo il trattamento con i liposomi, l’espressione del mRNA sia di Bcl-2 sia di Bcl-XL è stata down regolata, permettendo di sensibilizzare le cellule tumorali alla terapia con paclitaxel [44]. Utilizzando un metodo di irraggiamento a microonde, Shen et al. hanno formulato dei complessi di inclusione del gossipolo con β-ciclodestrine, la cui struttura è stata caratterizzata mediante NMR, FTIR e UV. Non è stata, però, verificata la loro attività biologica antiblastica [45]. Nanofibre di polilattide, preparate mediante elettrospinning, hanno dimostrato attività antitumorale nei confronti della linea cellulare HeLa. L’attività antiproliferativa mostrata da questi nanocarrier può essere attribuita all’induzione di apoptosi gossipolo-mediata [46]. Il derivato del gossipolo, megosina, dopo coniugazione con N-polivinilpirrolidone è risultato stabile in soluzione acquosa anche entro un ampio intervallo di pH. Questo composto ha dimostrato proprietà antiossidanti in quanto in grado di prevenire l’accumulo di perossidi lipidici e la formazione di liso-fosfolipidi causati dallo stress ossidativo indotto da CCl4 sulle membrane mitocondriali. Questo derivato è in grado di proteggere i mitocondri e la coniugazione ne mantiene la stabilità e le proprietà antiossidanti [47, 48]. Liu et al. hanno formulato nanoparticelle a base di (-)-gossipolo costituite da polietilenimmina coniugata con acido stearico. Queste nano particelle a doppio strato permettono il rilascio del farmaco direttamente nella regione tumorale, come dimostrato da immagini di fluorescenza. Esperimenti condotti in vitro e in vivo hanno dimostrato che il (-)-gossipolo rilasciato nei pressi del tumore riesce a sopprimere la crescita delle cellule cancerose e che i nanocarrier hanno mostrato un’ottima biocompatibilità, un rilascio di farmaco modulabile e una selettiva capacità di raggiungere il targettumorale [49]. Sono stati sviluppati anche sistemi di drug delivery che permettono di caricare più farmaci contemporaneamente. Micelle di polietilenglicole polimerizzate con ε-caprolattone permettono di incapsulare paclitaxel, ciclopamina e gossipolo. Tali micelle sono state utilizzate in colture 2D e 3D in vitro e tracciate con biofluorescenza in vivo nel trattamento del carcinoma ovarico. Sebbene in vitro le micelle non abbiano mostrato un miglioramento negli effetti terapeutici rispetto alla somministrazione di paclitaxel da solo, in vivo è stato osservato un potenziale significativo in quanto esse sono in grado di disaggregare per rilasciare i farmaci in esse caricati simultaneamente. Sempre in vivo, queste micelle hanno dimostrato di portare a un’inibizione della proliferazione cellulare con riduzione del volume tumorale e a un miglioramento della sopravvivenza in un modello murino in vivo. Sono stati formulati idrogel pH-sensibili, tramite cross-linking del gossipolo con un copolimero acrilamidico modificato con acido fenilboronico. L’idrogel è in grado di dissociare in presenza di acido lattico grazie all’interazione tra acido lattico e acido boronico. Occorre sottolineare che l’acido lattico è molto abbondante nelle cellule tumorali e nel microambiente del tumore stesso e questo idrogel permette di controllare il rilascio di gossipolo nel sito di azione cosomministrando altri farmaci (Figura 1).
Lo stesso gruppo di ricerca ha anche preparato nanoparticelle di silice mesoporosa caricate con gossipolo e mitoxantrone, nelle quali il legame estereo del boronato, sensibile al pH, viene utilizzato per coniugare il gossipolo, che può essere scisso nel microambiente acido tipico del tumore (Figura 2) [50-52].
Li et al. hanno preparato sistemi dual-drug per osservare l’azione combinata del derivato del gossipolo, ApoG2, con doxorubicina (DOX) nella terapia antitumorale. Si tratta di nanoparticelle dette mulberry-like con micelle anfifiliche di amido e acido ialuronico. L’ApoG2 è stato incapsulato con amido, mentre la DOX è stata caricata con acido ialuronico. Le nanoparticelle possono essere auto assemblate formando la struttura mulberry-like. La somministrazione di queste nano particelle mostra l’ottenimento di effetti antitumorali amplificati [53]. L’osservazione comune a tutti gli studi sull’incapsulazione del gossipolo in nanocarrier è che la tossicità del farmaco in questi sistemi viene fortemente controllata senza alterare le proprietà antitumorali.
Conclusioni
Il gossipolo e i suoi derivati hanno mostrato una potente attività antitumorale nei confronti di numerose patologie. Per questo motivo la ricerca scientifica si è incentrata sullo studio dei molteplici meccanismi d’azione esibiti da tale molecola. Il gossipolo è in grado di esplicare attività antitumorale inducendo apoptosi delle cellule neoplastiche attraverso diverse vie:
– Attività sulle proteine della famiglia Bcl-2: le proteine Bcl-2 sono localizzate sulla membrana mitocondriale e sulla membrana cellulare e la loro maggior funzione è quella di inibire l’apoptosi arrestando il ciclo cellulare nella fase G0/G1. Tali proteine sono sovra espresse in molte tipologie di tumori solidi, quali carcinoma mammario, prostatico e polmonare. Le proteine appartenenti a questa famiglia possiedono un dominio di legame BH3 fondamentale per l’attività anti apoptotica. Il gossipolo agisce come mimetico del dominio BH3 bloccando l’etero dimerizzazione della proteina, portando all’apoptosi delle cellule tumorali.
– Induzione dell’apoptosi caspasi dipendente: le caspasi sono proteine regolatrici del processo apoptotico in numerose cellule tumorali e il gossipolo è in grado di indurre apoptosi proprio attraverso un meccanismo caspasi-dipendente.
– Apoptosi mediata da meccanismo mitocondriale: il gossipolo è in grado di indurre una variazione del potenziale della membrana mitocondriale con una modificazione della permeabilità che comportano il rilascio di marker apoptotici, quali citocromo C e fattori di induzione dell’apoptosi (AIF) dal mitocondrio al citoplasma.
– Effetti sui fattori di crescita e sui recettori per i fattori di crescita: quali il Vascular Endotelial Growth Factor (VEGF). L’inibizione di questo fattore di crescita mediata dal gossipolo (inibizione del legame proteina MDM2-mRNA del fattore di crescita che comporta un aumento di traduzione di VEGF) induce l’autoubiquitinazione della proteina MDM2 con inibizione simultanea della traduzione del mRNA di VEGF che porta sia ad apoptosi della cellula tumorale sia a soppressione dell’angiogenesi nel tumore stesso.
– Effetti sul ciclo cellulare: il gossipolo è in grado di arrestare il ciclo cellulare e alterare l’attività di alcuni enzimi fosfatasi o chinasi nella pathway dei segnali cellulari. Il trattamento con gossipolo induce l’arresto del ciclo cellulare nella fase G0/G1 e induce apoptosi.
– Altri meccanismi: azione sulla telomerasi, un complesso ribonucleoproteico con attività di transcrittasi inversa che mantiene lo stato di divisione cellulare. Il gossipolo è in grado di indurre apoptosi e reprimere l’attività telomerasica attraverso una downregolazione trascrizionale e una modificazione post raduzionale di hTERT, la subunità catalitica della telomerasi.
Oltre ad essere un promettente farmaco antitumorale, il gossipolo sembra in grado di sensibilizzare le cellule nei confronti di altre terapie antineoplastiche. E’ stato osservato un sinergismo con la chemioterapia classica: tale molecola è in grado di inibire i meccanismi molecolari alla base dell’insorgenza delle resistenze nella terapia del cancro al colon con 5–fluorouracile. Allo stesso modo, permette di superare il problema dell’insorgenza delle resistenze al trattamento con gemcitabina del tumore al seno, al polmone, al pancreas e alle ovaie: resistenze provocate dalla famiglia delle proteine Bcl-2. È stato osservato anche un interessante sinergismo nel trattamento dei pazienti oncologici con radioterapia. Anche in questo caso la radio-resistenza che si verifica nel trattamento di alcuni tipi di tumore, come il cancro alla prostata, è dovuta a una sovraespressione significativa delle proteine della famiglia Bcl-2. Pertanto, l’associazione della radioterapia alla terapia con gossipolo porta a interessanti risultati. Il gossipolo presenta tuttavia effetti citotossici e, per ovviare a questo problema, sono stati sviluppati nanocarriers caricati con gossipolo, molto utili per veicolare il farmaco alle cellule target e diminuire quindi la tossicità sistemica.
Sono stati sviluppati numerosi tipi di nano carriers tra cui:
– Nanoparticelle a base di olio di cotone,
– Nanocarriers a base di polilattide,
– Nanocarriers a doppio strato,
– Nanocarriers che permettono il caricamento multifarmaco,
L’osservazione comune a tutti gli studi di incapsulazione del gossipolo in nanocarrier è che la tossicità del farmaco in questi sistemi viene fortemente controllata senza alterazione delle proprietà antitumorali. Il gossipolo rappresenta una nuova frontiera nel campo dell’oncologia in quanto permette di sfruttare differenti meccanismi d’azione. Ha prodotto ottimi risultati se associato alle terapie farmacologiche o radianti classiche e può essere veicolato in tools che ne permettono il rilascio selettivo al sito di interesse, con una significativa diminuzione degli effetti collaterali. Pertanto appare auspicabile che l’utilizzo di molecole innovative porti a un miglioramento nella prognosi dei pazienti affetti da patologie neoplastiche.
* Farmacia Dallavalle, Piacenza
** UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PAVIA – Dipartimento di Scienze del Farmaco
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Beatrice Zuffada, Cinzia Boselli, Francesco Saverio Robustelli della Cuna
La ricerca scientifica è focalizzata sullo studio dei molteplici meccanismi d’azione del gossipolo, una molecola estratta dalle piante del genere Gossypium, che insieme ai suoi derivati ha dimostrato di possedere una notevole attività antitumorale. Sono numerosi gli studi sull’utilizzo di nanocarriers di varia natura che siano in grado trasportare questa molecola al suo sito bersaglio, controllandone la citotossicità senza alterare le proprietà antitumorali.
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