*Massimo Maffei
Il cranberry, piccolo frutto di origine americana, presenta un profilo fitochimico differente da quello del parente europeo Vaccinium vitis-idea, essendo caratterizzato da un alto contenuto di proantocianidine, sostanze in grado di bloccare l’adesione dei batteri alle cellule, impedendone così l’ingresso e il progredire dell’infezione. Questa proprietà, caratteristica peculiare del cranberry, si rivela un’ottima strategia anche nei confronti dei virus, in particolare l’Herpes simplex e quelli dell’influenza.
Il mirtillo rosso americano (Vaccinium macrocarpon Aiton), e in particolare il suo succo, sono sicuramente una delle preparazioni botaniche più note per il trattamento e la prevenzione delle infezioni urinarie (Maffei, 2016). Tuttavia gli estratti di mirtillo rosso americano sono anche noti per le loro proprietà antivirali. Considerando l’incidenza globale significativa, la morbilità e il tasso di mortalità delle infezioni virali, lo sviluppo di nuovi e sicuri prodotti con attività antivirale è di alta priorità (Obiero et al., 2012). Pertanto, gli inibitori di adesione/ingresso cellulare che bloccano la diffusione e la trasmissione del virus attraverso un contatto personale ravvicinato possono fornire un metodo realistico di intervento microbicida. Inoltre, data la capacità di molti virus di stabilire la latenza e di riattivarsi frequentemente, risulta importante che per impedire la loro trasmissione il microbicida ideale deve impedire l’insorgenza di infezioni. Da questo punto di vista, gli estratti naturali che impediscono l’attacco dei virus alle cellule bersaglio possono essere più vantaggiosi. Inoltre, diversi polianioni e dendrimeri caricati negativamente che, negli ultimi anni, sono stati selezionati per lo sviluppo come candidati microbicidi, a causa della loro capacità di bloccare l’adesione virale e l’ingresso nelle cellule bersaglio, testimoniano l’idoneità di questa strategia per contrastare le infezioni virali (Luganini et al., 2010; 2011).
Virus influenzali e Herpes
I virus dell’influenza di tipo A e di tipo B (IAV, IBV) sono patogeni principali diffusi tra le popolazioni umane e sono responsabili di epidemie stagionali e pandemie (Paules e Subbarao, 2017). Attualmente, i vaccini stagionali rappresentano la misura più efficace per prevenire e controllare le infezioni da IV (Houser e Subbarao, 2015). Tuttavia, la profilassi e il trattamento delle infezioni da IV possono anche beneficiare di due classi di farmaci autorizzati: inibitori della matrice proteica e inibitori della neuraminidasi (Ison, 2015). Gli inibitori della matrice proteica, come amantadina e rimantadina, inibiscono il rivestimento virale degli endosomi interferendo con l’acidificazione mediata dal canale ionico M2 (Hay, 1992). Questi farmaci sono efficaci solo contro l’IAV e il loro uso è limitato dalla bassa efficacia, dagli effetti collaterali e dall’emergere di ceppi resistenti (Suzuki et al., 2003). Gli inibitori della neuraminidasi (NAI), come l’oseltamivir e lo zanamivir, inibiscono il rilascio di progenie virale dalle cellule infette e rappresentano attualmente la terapia di prima linea contro le infezioni influenzali (Ison, 2015). Nonostante l’efficacia di questi farmaci antivirali nei confronti sia di IAV che di IBV, il numero di virus in circolazione resistenti alla NAI è notevolmente aumentato negli ultimi anni (McKimm-Breschkin, 2013). Più recentemente, due nuove NAI sono state approvate per il trattamento dell’influenza – peramivir e laninamivir ottanoato – che sono state proposte come terapia combinata per prevenire la comparsa di resistenza (Alame et al., 2016). Tuttavia, diversi ceppi che sono resistenti a entrambe queste nuove NAI sono già stati isolati (Takashita et al., 2016). Alla luce di questi fatti, il controllo delle infezioni da IV presenta ancora sfide importanti e quindi vi è un’urgente necessità di sviluppare composti anti-IV alternativi che siano efficaci contro virus antigenicamente diversi e caratterizzati da nuovi meccanismi di azione (Van de Wakker et al., 2017).
Molecole naturali come antivirali
Molte sostanze fitochimiche come i fenoli, i polifenoli, i terpeni e i flavonoidi di molte specie vegetali esercitano attività antivirali. In particolare, si è stato scoperto che i polifenoli interferiscono con le prime fasi del ciclo replicativo del virus Herpes simplex (HSV) e/o direttamente con le particelle virali. Dati sperimentali indicano che estratti di Rumex acetosa e Myrothamnus flabellifolia arricchiti di polifenoli esercitano attività antivirale contro HSV-1, attraverso l’inibizione della capacità del virus di aggradire le cellule bersaglio. L’effetto anti-adesivo dell’estratto di R. acetosa è principalmente dovuto alla presenza di proantocianidine con legame di tipo B (PAC-B), epicatechina-3-O-gallato-(4β→8)-epicatechina-3-O-gallato, dimostrando così un’associazione tra la perdita di infettività di HSV-1 e le alterazioni della glicoproteina dell’involucro, coerenti con l’interazione delle PAC di tipo B con la superficie del virione (Gescher et al., 2011). Si è quindi concluso che il dimero PAC-B derivato da R. acetosa blocca l’adsorbimento di HSV-1 interagendo direttamente con le particelle virali e causando alterazioni delle glicoproteine dell’involucro, come gD, che mediano il legame delle particelle virali ai recettori cellulari.
Polifenoli, flavonoidi, glucosidi e alcaloidi estratti da diverse piante e frutti hanno anche mostrato attività anti-IV (Bahramsoltani et al., 2016). Tra gli estratti di piante contenenti polifenoli, quelli ricchi di proantocianidine di tipo A (PACs-A) ottenuti dal mirtillo rosso esercitano attività antimicrobiche sulla base della loro riconosciuta attività antiadesiva (Krueger et al., 2013). Pertanto, gli estratti di mirtillo rosso possono anche rappresentare una fonte di potenziali composti per impedire l’adesione virale sulle cellule bersaglio. In effetti, le attività antivirali degli estratti di mirtillo sono efficaci contro Reovirus (Lipson et al., 2007), Enterovirus (Su et al., 2010), e persino contro IV (Sekizawa et al., 2013). Tuttavia, la mancanza di studi meccanicistici e la standardizzazione dei processi produttivi per mantenere concentrazioni comparabili di componenti bioattivi, hanno limitato lo sviluppo di prodotti a base di mirtillo rosso come antivirali contro le infezioni da IV.
Recentemente, si è dimostrato che il nuovo estratto di mirtillo rosso americano Oximacro®, che è caratterizzato da un elevato contenuto di PAC di tipo A, è efficace nella prevenzione delle infezioni del tratto urinario (Occhipinti et al., 2016). Studi recenti hanno anche dimostrato l’efficacia di questo estratto come potente antivirale naturale.
Il mirtillo rosso americano agisce da potente antivirale contro Herpes virus
L’estratto di mirtillo rosso agisce come agente anti-influenzale ad azione diretta. La sua attività antivirale è stata valutata in vitro sulla replicazione di HSV-1 e HSV-2 (Terlizzi et al., 2016). Il pretrattamento di cellule Vero con l’estratto 1 h prima dell’infezione ha prodotto una significativa inibizione concentrazione-dipendente dei due isolati clinici di HSV-1 e HSV-2 (vedi Figura X).
L’analisi della modalità d’azione ha rivelato che l’estratto di mirtillo rosso americano impedisce l’adesione di HSV-1 e HSV-2 alle cellule bersaglio. Cellule Vero precongelate sono state trattate con varie concentrazioni di estratto, o eparina a 4 °C per 30 min e poi l’infezione è stata effettuata con HSV-1 oppure HSV-2 preraffreddati ad una MOI di 0,002 per 3 ore a 4 °C in presenza di composti come indicato nella Figura Y. L’estratto compromette l’adesione di HSV in modo concentrazione-dipendente e in misura simile a quella osservata nella resa dei virus.
Per valutare se sia l’estratto totale di mirtillo rosso americano o se invece siano solo le PAC-A a esercitare l’attività biologica sul virus Herpes è stata analizzata l’attività anti-HSV delle frazioni purificate dall’estratto. Gli studi hanno rivelato che solo le frazioni corrispondenti a dimeri e trimeri di PAC-A sono responsabili dell’attività inibitoria. Ulteriori studi meccanicistici hanno confermato che l’etratto di mirtillo rosso americano e le sue PAC-A hanno come target le glicoproteine gD e gB dell’involucro virale, con conseguente perdita dell’infettività delle particelle di HSV. Inoltre, l’estratto ha mantenuto completamente la sua attività anti-HSV anche a pH acidi (3.0 e 4.0) e in presenza di proteine del siero umano al 10%; condizioni che imitano le proprietà fisiologiche della vagina – un potenziale target terapeutico dell’estratto. Presi insieme, questi risultati indicano che questo etratto di mirtillo rosso americano è un candidato attraente per lo sviluppo di nuovi microbicidi di origine naturale per la prevenzione delle infezioni da HSV.
La rappresentazione schematica mostrata nella Figura Z mostra l’interazione tra le PAC di tipo A presenti nell’estratto di mirtillo rosso americano e le glicoproteine dell’involucro esterno del virus HSV. Oximacro® lega l’ectodominio delle glicoproteine di HSV (gD e gB) in modo dipendente sia dalla concentrazione che dal tempo, inibendo quindi le loro funzioni di adesione e ingresso virus nelle cellule. Tuttavia, allo stato attuale, non è ancora chiaro se le interazioni tra le PAC di tipo A e le glicoproteine che rivestono HSV provochino alterazioni dei domini di proteine specifiche, o se le PAC di tipo A “avvolgano” semplicemente le glicoproteine (come mostrato nella Figura Y), impedendo di fatto l’accesso ai loro normali partner di legame sulle cellule bersaglio
Le PAC-A del mirtillo rosso sono potenti antivirali contro Influenza A e B
Questo estratto di mirtillo rosso americano inibisce anche la replicazione dei virus dell’influenza A e B (IAV, IBV ceppo H1N1) in vitro sempre a causa del suo alto contenuto di dimeri e trimeri di proantocianidine di tipo A (PAC-A) (Luganini et al., 2018). L’analisi della modalità d’azione ha rivelato che previene l’adsorbimento e l’ingresso di IAV e IBV nelle cellule bersaglio ed esercita un’attività virucida. L’estratto interagisce con l’ectodominio della glicoproteina di emoagglutinina (HA), con la conseguente perdita di infettività delle particelle di IV. La spettroscopia a fluorescenza ha rivelato una riduzione della fluorescenza intrinseca della proteina HA dopo incubazione con PAC-A dimerica purificata (PAC-A2), confermando così un’interazione diretta tra HA ed i dimeri di PAC-A presenti nell’estratto (Figura K).
Le simulazioni di ancoraggio in silico hanno ulteriormente supportato i risultati in vitro e indicato che tra i diversi componenti del profilo chimico dell’estratto di mirtillo rosso, sono esclusivamente le PAC-A2 che mostrano la migliore propensione al legame con un’affinità inferiore a 10 nM (Figura W).
Il ruolo delle PAC-A2 nell’attività anti-IV è stato ulteriormente confermato dall’osservazione che l’estratto di mirtillo rosso americano ha impedito la replicazione di IAV e IVB e causato la perdita di infettività delle particelle di IV, indicando quindi nelle PAC-A2 il suo principale componente attivo. Considerati insieme, questi risultati dimostrano che questo estratto di Vaccinium macrocarpon è un candidato attraente per lo sviluppo di nuovi antivirali di origine naturale per la prevenzione delle infezioni da virus dell’influenza.
Conclusioni
Complessivamente, i meccanismi di azione descritti per l’estratto oggetto dello studio contro IV e HSV sostengono la potenziale applicazione di estratti di mirtillo rosso americano ad elevato contenuto standardizzato di PAC-A nella prevenzione delle infezioni virali. È quindi possibile prevedere che un’applicazione locale di tali estratti nel tratto respiratorio superiore consentirebbe alle PAC-A attive di inattivare il virus infettante dell’influenza, prevenendo così il verificarsi di un’infezione. Allo stesso modo, applicazioni topiche o per os, sfruttando la capacità delle PAC-A del mirtillo rosso di impedire l’attacco HSV-1 e HSV-2, potrebbero essere utilizzate per prevenire l’insorgenza di infezioni da Herpes virus. Queste proposte sono sostenute anche dall’elevato profilo di sicurezza che molte formulazioni di estratti secchi di mirtillo rosso hanno dimostrato nel loro uso diffuso per prevenire le infezioni del tratto urinario (UTI) (Blumberg et al., 2013). Tuttavia, lo sviluppo di estratti di Vaccinium macrocarpon come aiuto antivirale richiede la valutazione in modelli in vivo di infezione acuta per determinare se debba essere proposto come un nuovo principio attivo di agenti antivirali ad ampio spettro di origine naturale idonei a prevenire le infezioni sia da IV che da Herpes virus.
*UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI TORINO
Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi
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