* Tiziana Esposito
* Teresa Mencherini
** Serena Lembo
* Patrizia Gazzerro
* Francesca Sansone
* Giuseppe Chiuccariello
* Patrizia Picerno
* Rita Patrizia Aquino
Nell’ottica di un’economia sostenibile e circolare, l’attenzione della ricerca scientifica negli ultimi anni si rivolge frequentemente allo studio degli scarti e dei sottoprodotti della filiera agricola come fonte di molecole bioattive da utilizzare in ambito farmaceutico, nutraceutico e cosmetico. I ricci delle castagne si rivelano un promettente ingrediente per la formulazione di cosmetici naturali ed efficaci.
INTRODUZIONE
La produzione di castagne, frutto edibile delle specie Castanea (Fagaceae), è ampiamente diffusa a livello mondiale, soprattutto in due macroaree, l’Asia e l’Europa, che rappresentano rispettivamente l’80% e il 16% della produzione. Il primo produttore europeo è l’Italia dove la castanicoltura è concentrata in in cinque regioni. Tra queste la Campania, in particolare la provincia di Avellino, rappresenta oltre il 50% della produzione nazionale con una media annua di 26-28 mila tonnellate di prodotto, seguono la Calabria, il Lazio, il Piemonte e la Toscana (www.istat.it/censimento-agricoltura 2010). Annualmente la raccolta del frutto, destinato in parte al consumo fresco e soprattutto alla trasformazione industriale (prodotto secco, farina e marron-glacé) viene fatta, tradizionalmente a mano, tra settembre e novembre. Durante questa fase, grandi quantità dell’involucro spinoso (riccio) che protegge il frutto vengono lasciate, come scarto, sul terreno. I produttori castanicoli sono costretti a rimuovere i ricci residui perché essi facilitano la crescita di insetti (Vázquez et al. 2012) che possono danneggiare la coltivazione riducendo la quantità e la qualità della produzione del frutto nell’annata successiva. Negli ultimi anni, nell’ottica di un economia sostenibile e circolare, grande attenzione è stata rivolta dalla ricerca scientifica allo studio degli scarti e dei sottoprodotti della filiera agroalimentare come fonte di molecole bioattive da utilizzare nel settore farmaceutico, nutraceutico e cosmetico (Aires et al. 2016; Balboa et al. 2014; Braga et al. 2015). La valorizzazione di questi scarti/sottoprodotti come ingredienti funzionali potrebbe risolvere il problema economico e/o ambientale del loro smaltimento, trasformandoli, anzi, in fonte di guadagno per l’azienda agroalimentare, e dall’altra parte rappresentare una materia prima nuova, a basso costo e facilmente reperibile. Recenti studi hanno dimostrato che i ricci di castagna sono ricchi in carboidrati, amminoacidi essenziali, fibre (Pinto et al. 2017), tocofenoli e tocotrienoli, oltre che polifenoli ad azione antiossidante (Fernández-Agulló et al. 2008; Pinto et al. 2017). L’obiettivo del lavoro di ricerca riassunto in questo articolo, è stato quello di produrre un ingrediente fitoattivo dai ricci di castagna, di verificarne la sicurezza d’uso e di riuscire ad incorporarlo in un’emulsione cosmetica (Figura 1). Della formulazione topica sviluppata è stata valutata la stabilità (pH, viscosità, stabilità chimica dell’attivo) nel tempo (fino a 6 mesi) e la tollerabilità cutanea su volontari sani.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Produzione e caratterizzazione chimica e funzionale dell’estratto di ricci di castagna
I ricci di castagna oggetto dello studio sono stati raccolti a metà ottobre del 2016 in un castagneto in provincia di Avellino, essiccati all’aria e polverizzati. L’estratto idroalcolico è stato preparato mediante macerazione dinamica per 30 minuti a T 45 °C con etanolo acquoso (50% v/v). Il fitoestratto prodotto presenta un elevato contenuto in polifenoli totali (TPC), determinato mediante il test spettrofotometrico di Folin Ciocalteu (Sansone et al. 2016), ed espresso come equivalenti di acido gallico (206.000 GAE µg/mg estratto). Al TPC è dovuta la significativa e concentrazione-dipendente attività scavenging dell’estratto nei confronti dei due radicali DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazile) e ABTS (acido 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico) con rispettivamente, IC50 = 26,960 μg/mL e valore TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) = 3,00 mMtrolox/mg estratto. Sulla base di questi risultati preliminari, l’estratto di ricci di castagna si presenta come un interessante derivato fitoattivo.
Citotossicità del fitoestratto
Affinché una materia prima possa essere utilizzata in modo sicuro in un prodotto cosmetico, escludendo effetti negativi sulla salute del consumatore finale, è necessario dimostrarne l’assenza di citotossicità in vitro. L’effetto dell’estratto idroalcolico di ricci, ricco in polifenoli, sulla crescita di cheratinociti umani immortalizzati (HaCaT) è stato valutato mediante test MTT (Esposito et al. 2017). I risultati hanno dimostrato che, dopo 24 h di incubazione, l’estratto stimola la proliferazione dei cheratinociti e dopo 48h di trattamento, la vitalità cellulare rimane > del 65% anche alla concentrazione di estratto più alta testata (1,0 mg/mL). I risultati ottenuti supportano, quindi, la sicurezza d’uso dell’ingrediente fitoattivo in una formulazione topica cutanea.
Formulazione dell’emulsione O/A veicolante il fitoestratto
Nel corso del presente lavoro di ricerca è stata, quindi, sviluppata e prodotta un’emulsione cosmetica O/A in cui incorporare l’estratto di ricci di castagne come ingrediente funzionale. Le materie prime, identificate con un nome INCI, International Nomenclature Cosmetic Ingredients, sono state scelte tra quelle approvate ad uso cosmetico e riportate nell’Inventario Europeo degli Ingredienti Cosmetici (Gazzetta ufficiale europea, 2009). In particolare la formulazione base (A) è caratterizzata dalla presenza di un emulsionante non ionico etossilato ad elevata idrofilia e di un’elevata percentuale di ingredienti di origine naturale (Olea Europaea e Olea Europea Oil Unsaponifiables, Simmondsia Chinensis Oil, Xanthan Gum), combinati con ingredienti di sintesi ad elevata tollerabilità cutanea (Caprylic Capric Triglyceride, Coco-Caprylate, C12-15 Alkyl Benzoate) e un sistema conservante paraben free (Benzoic acid, Dehydroacetic Acid, Ethylexylglycerin, Phenoxyethanol) scelti per ottenere un prodotto multifunzionale e altamente dermocompatibile. L’emulsione B differisce dalla A per l’aggiunta di estratto allo 0,3% p/p, concentrazione che garantisce l’efficacia free radical scavenging dell’attivo. In effetti, la percentuale utilizzata è di circa 100 volte superiore alla IC50 determinata mediante il test del DPPH e rappresenta il limite massimo di utilizzo. Infatti, percentuali più elevate di estratto (già 0,5% p/p) modificano eccessivamente le caratteristiche organolettiche (odore e colore) della formulazione, con un colore che vira dal bianco della formulazione B al marrone intenso della formulazione allo 0,5% di estratto. Le emulsioni sono state preparate con un metodo caldo/caldo diretto.
Caratterizzazione delle emulsioni cosmetiche A e B
Test di stabilità accelerata
L’obiettivo principale di condurre test di stabilità per un prodotto cosmetico è di assicurarsi che non si verifichino, durante il trasporto, lo stoccaggio e la manipolazione, alterazioni delle proprietà fisiche, chimiche e microbiologiche con ricadute negative sulla sua sicurezza d’uso oltre che sulle prestazioni funzionali. Al fine di verificare la stabilità chimico-fisica dell’emuslione A e l’effetto dell’aggiunta del fitoestratto, le formulazioni A e B sono state conservate a diverse temperature di stoccaggio (4°C, 25°C e 45°C) per 6 mesi. A tempi stabiliti (48h, 7 e 15 giorni, 1, 3 e 6 mesi) sono state controllate le caratteristiche organolettiche (aspetto, colore, odore) e determinate le caratteristiche chimico-fisiche (pH, viscosità e stabilità in centrifuga). Le prove a Temperatura ambiente (25°C), sono predittive del comportamento del prodotto quando conservato in condizioni adeguate di stoccaggio; le prove effettuate a 4°C sono necessarie per stabilire il comportamento del prodotto durante lo stoccaggio ed il trasporto nei periodi invernali; le prove in termostato, a 45°C, invece, sono considerate test di “invecchiamento accelerato” predittive del comportamento del prodotto stoccato e trasportato nei periodi caldi. L’incorporazione dell’estratto idroalcolico di ricci modifica il colore della formulazione che passa dal bianco all’avorio (Figura 2), ma non la stabilità delle emulsioni in centrifuga. Inoltre, il fitoestratto non causa variazioni significative di pH e viscosità fino a 6 mesi e a tutte le temperature di stoccaggio. Il pH delle emulsioni A e B risulta dermocompatibile (tra 5.29 e 5.58) e in base ai valori di viscosità (tra 25.310 e 32.719 mPa•s) le due emulsioni sono classificabili come consistenti (Proserpio 1999) e ottimali per il confezionamento in vasetto. I risultati ottenuti evidenziano la stabilità fisica delle emulsioni A e B e l’influenza dell’estratto vegetale esclusivamente sulla colorazione della formulazione.
Estrazione del fitoattivo dalla formulazione B e determinazione del TPC
Al fine di valutare la stabilità chimica dell’estratto di ricci di castagna dopo l’incorporazione nell’emulsione O/A è stata applicata una procedura di recupero dell’attivo dalla formulazione (Sansone et al. 2016). Sull’estratto recuperato dopo 48 h e 6 mesi dalla preparazione dell’emulsione, è stato determinato il TPC. I risultati hanno mostrato che la percentuale di estratto recuperata, corrisponde al 84,0% dell’estratto totale incorporato in formulazione con una variazione <1% tra t = 48 h e t = 6 mesi. Il recupero dell’estratto dalla formulazione bifasica risulta parziale (non pari al 100%), ma la percentuale costante fa supporre che sia dovuta ad un limite della metodica applicata e non alla mancata stabilità chimica dell’estratto in formulazione.
Test di permeazione in vitro
Il rilascio del fitoestratto funzionale dalla formulazione è un requisito fondamentale per garantire la sua permeazione attraverso l’epidermide e quindi l’ efficacia funzionale della formulazione stessa (Zillich et al. 2013). Per tale motivo la permeazione in vitro dell’estratto di ricci di castagna è stata valutata in seguito al suo rilascio dall’emulsione (B), mediante celle di Franz (Figura 3) dotate di una membrana sintetica di nitrocellulosa (Baert et al. 2010). I risultati hanno mostrano che, sulla base del valore di IC50 determinato mediante il test del DPPH, la concentrazione di fitoestratto capace di attraversare la membrana in 5 minuti (95.74 mg/cm2) è sufficiente per esplicare l’effetto free radical scavenging sulla cute.
Verifica della tollerabilità cutanea in vivo
Il patch test è un’importante tecnica utilizzata per la valutazione del potenziale irritante cutaneo di un prodotto cosmetico. Per il test epicutaneo, condotto in accordo ai principi della Buona Pratica Clinica e alla dichiarazione di Helsinki (1964 e successive modifiche), sono stati arruolati 20 volontari sani, di sesso femminile, di età compresa tra 20 e 36 anni (età media 29 anni) con pelle normale, fototipo di Fitzpatrick dal II al IV e rispondenti ai ctriteri di inclusione (assenza di stato di gravidanza e allattamento, storie personali o familiari di dermatite ed orticaria, allergie respiratorie, allergie a farmaci o cosmetici, trattamenti farmacologici sistemici ed esposizione a lampade abbronzanti in atto o nelle due settimane precedenti l’inizio del test). I volontari selezionati hanno firmato un consenso informato accettando modalità e restrizioni del test, quali: divieto di bagnare la zona di applicazione delle Finn chambers e divieto di svolgere attività che comportano un’eccessiva sudorazione (es. palestra). Le formulazioni A e B sono state applicate, usando Finn chambers da 7 mm, sulla parte esterna dell’avambraccio (rispettivamente dx e sx) (Figura 4) in modalità occlusiva per 48 ore e in open(contrassergnando la zona di applicazione dopo la rimozione del cerotto) per le successive 24 h. L’eventuale insorgenza di fenomeni irritativi visibili come eritema o edema è stata valutata dal medico dermatologo ed i risultati per ciascun volontario sono stati interpretati secondo la seguente scala: (-) assenza di reazione; (+/-) reazione dubbia; (+) lieve irritazione, possibile eritema, infiltrazione e papule; (++) forte irritazione, eritema, infiltrazione, papule e vescicole; (+++) reazione molto forte, eritema intenso, infiltrazione e vescicole coalescenti; (IR) reazione irritante di vatrio tipo. Le emulsioni A e B sono risultate non irritanti (-) per tutti i volontari sia dopo 48 h di applicazione in occlusiva che dopo le successive 24 h dalla rimozione del prodotto.
CONCLUSIONI
Il lavoro di ricerca presentato ha permesso di sviluppare un ingrediente funzionale da scarti della raccolta delle castagne. Infatti, l’estratto idroalcolico dei ricci, con una sifìgnificativa attività free radical scavenging, è stato incorporato con successo in un’emulsione cosmetica O/A. Le fasi di produzione e di stoccaggio della formulazione non alterano la composizione polifenolica del fitoestratto e, quindi, la sua efficacia funzionale. D’altra parte, l’aggiunta dell’estratto vegetale non modifica la stabilità (pH, viscosità, prova in centrifuga) dell’emulsione, che risulta un veicolo idoneo per il rilascio del fitoattivo sulla cute. Infine, la dimostrata tollerabilità cutanea in vivo supporta la sicurezza d’uso della formulazione sviluppata. L’insieme dei risultati ottenuti lasciano ipotizzare, quindi, il recupero e la valorizzazione di un prodotto ad oggi considerato uno scarto della filiera agroalimentare come ingrediente dermoattivo.
* UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO
Dipartimento di Farmacia, Master di II livello in Scienza e Tecnologia Cosmetiche.
** UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO
Dipartimento di Medicina, Chirurgia e Odontoiadria “Scuola Medica Salernitana”
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www.istat.it/censimento-agricoltura 2010
Natural 1
L’industria agro-alimentare genera un’elevata quantità di scarti, in massima parte non pericolosi, solitamente destinati allo smaltimento come previsto dall’art. 7 del D.lgs.22/97. In Europa la produzione di scarti agro-alimentari viene stimata intorno ai 250 milioni di t/anno e in Italia la maggior parte di questi rifiuti sono sottoprodotti dell’industria di lavorazione dei cereali (11 milioni di t/anno), della vite (2,3 milioni di t/anno) e delle olive (1,2 milioni di t/anno). Negli ultimi anni la ricerca scientifica ha rivolto un’attenzione sempre maggiore verso il recupero e la valorizzazione di tali sottoprodotti e scarti, che spesso risultano interessanti per la presenza di molecole bioattive naturali, spesso in concentrazioni paragonabili o addirittura superiori rispetto alla parte edibile, con potenziali effetti benefici sulla salute umana. Per cui, gli scarti agroalimentari sono una risorsa che, opportunamente trattata, può generare materie prime nuove a costo ridotto, destinate alla produzione di prodotti salutistici, quali alimenti funzionali, integratori alimentari, cosmetici e prodotti farmaceutici, o di pellicole o rivestimenti “attivi” (antiossidanti, antimicrobici, ecc.) in grado di aumentare la shelf-life degli alimenti (Sansone et al., 2019).
Valorizzare un prodotto considerato “scarto” può contribuire da una parte a risolvere il problema della gestione e dello smaltimento con una notevole ricaduta economica sull’azienda produttrice e sulla salvaguardia dell’ambiente, dall’altra a soddisfare le esigenze del settore dei prodotti salutistici, sempre alla ricerca di nuovi ingredienti di origine naturale facilmente reperibili ed eco-sostenibili.
Il riutilizzo di rifiuti e sottoprodotti di biomasse vegetali come ingredienti funzionali per la salute umana, però, richiede un complesso processo di recupero delle molecole benefiche, loro caratterizzazione chimica quali-quantitativa, indagine della attività biologica e, a seconda dell’utilizzo finale, un’opportuna trasformazione tecnologica in ingredienti stabili nel tempo, facilmente manipolabili e, dunque, utilizzabili a livello industriale. Diversi inconvenienti, infatti, possono limitare un efficiente impiego degli estratti vegetali, come le caratteristiche organolettiche (materiali appiccicosi, con odore penetrante e sapore sgradevole), la bassa solubilità in acqua o nei fluidi biologici e la stabilità critica nel tempo. La produzione di microparticelle, mediante tecnica spray drying, è una strategia per convertire gli estratti derivanti da rifiuti e sottoprodotti in una polvere particellare, utilizzabile per forme di dosaggio orali o topiche, in cui il derivato vegetale è opportunamente stabilizzato in una matrice polimerica.
La ricerca scientifica universitaria di base non rimane insensibile al nuovo obiettivo di sfruttare le risorse agroalimentari in modo efficiente e sostenibile e, negli ultimi anni, il Dipartimento di Farmacia dell’Università di Salerno è stato protagonista di progetti congiunti fra mondo accademico e aziende del settore per sviluppare nuovi ingredienti funzionali da industrie di trasformazione di prodotti fortemente legati al territorio della regione Campania, quali frutta a guscio (nocciole e castagne).
Analisi chimica e biologica di estratti da scarti e sottoprodotti della trasformazione della frutta a guscio
Il nocciolo (Corylus avellana L.), così come il castagno (Castanea sativa Miller.), sono tra le specie più coltivate in Italia, in particolare in Campania, Toscana, Calabria, Emilia-Romagna, Piemonte, Liguria e Lazio (Esposito et al., 2017; Vella et al., 2018). I frutti edibili sono destinati in piccola parte al consumo fresco e in gran parte trasformati e commercializzati come prodotti secchi o destinati a diversi settori alimentari (panetteria e pasticceria). Dai processi di sgusciatura e tostatura delle nocciole vengono generate ingenti quantità di gusci legnosi e pellicine sottili, mentre i ricci di castagna sono il principale scarto generato durante la fase di raccolta del frutto.
Attualmente, i gusci e le pellicine trovano un limitato uso come combustibile, materiale per pacciamatura o nell’alimentazione animale; i ricci, non trovando altra collocazione, vengono ammucchiati e bruciati dai coltivatori per evitare la loro degradazione sul terreno, con conseguente crescita di larve e insetti, potenzialmente dannosi per il raccolto successivo.
L’interesse per queste biomasse è nato dalla presenza in letteratura scientifica di lavori che evidenziavano in esse la presenza di molecole antiossidanti con potenziali effetti benefici sulla salute umana, per esempio nel trattamento e nella prevenzione di patologie come neoplasie, aterosclerosi e patologie neurodegenerative in cui lo stress ossidativo è altamente implicato (Alasalvar et al., 2006; Esposito et al., 2019).
Le biomasse, essiccate e polverizzate, sono state sottoposte a processi estrattivi mediante macerazione solido/liquido, per l’ottenimento di estratti alcolici e idroalcolici con l’obiettivo di determinarne il profilo chimico e investigare l’attività biologica (Esposito et al., 2017 e 2019; Piccinelli et al., 2016).
L’estratto alcolico ottenuto dai gusci è stato sottoposto ad una procedura di frazionamento mediante tecniche cromatografiche (a esclusione molecolare, HPLC con detector a indice di rifrazione o a serie di diodi, DAD) per isolare e determinare (attraverso spettrometria di massa e spettroscopia NMR) la struttura chimica dei principali polifenoli presenti, identificati come neolignani (balanofonina, ficusale, lawsonicina e cedrusina), composti fenolici (acido gallico e il suo metil-estere, acido vanillico, acido veratrico, alcool diidroconiferile, C-veratroilglicole, β-idrossipropiovanillone) e un diarileptanoide (carpinontriolo B). L’estratto, inoltre, è stato titolato nei suoi markers principali, la lawsonicina (2.93%, p/p), il C-veratroilglicole (1.98%, p/p) e la cedrusina (1.79 %, p/p).
La composizione chimica degli estratti alcolici e idroalcolici ottenuti dalle pellicine di nocciola e dai ricci di castagna è stata analizzata mediante l’utilizzo di spettrometria di massa a elevata risoluzione (HPLC-UV-HRMS, HRMS-FIA e HPLC-HRMSn). L’analisi ha evidenziato, nell’estratto di pellicine la presenza di tannini condensati (proantocianidine) ad alto peso molecolare, principalmente formati da unità di (epi)-catechina ed (epi)-gallocatechina o da derivati dell’acido gallico; gli estratti di ricci di castagna, invece, sono risultati ricchi di tannini idrolizzabili, principalmente ellagitannini, e flavonoli glicosidici e i polifenoli, acido ellagico e chestanina, sono risultati i composti maggioritari (5-79 e 1-13 mg/g di estratto secco, rispettivamente).
Le procedure analitiche applicate hanno consentito di ottenere il profilo chimico completo degli estratti preparati, inoltre, la loro titolazione nei markers chimici garantisce la standardizzazione e la riproducibilità del metodo estrattivo e dell’efficacia biologica.
Tutti gli estratti preparati si sono dimostrati dei potenziali ingredienti funzionali ad attività antiossidante, per la loro significativa attività free radical scavenging, correlata al contenuto in polifenoli totale, nei confronti dei radicali 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) e acido 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico) (ABTS).
Ciascun estratto poi è stato investigato per specifiche attività biologiche, sulla base del peculiare profilo chimico di ogni estratto.
Poiché diversi lavori in letteratura riportavano l’attività antiproliferativa di neolignani (Huang et al., 2013; Chung et al., 2011; Mencherini et al., 2011) e di composti fenolici come l’acido gallico (Lo et al., 2010; Gonzales-Sarries et al., 2012) su diverse linee cellulari tumorali è stata valutata l’attività antiproliferativa dell’estratto di gusci di nocciola, ricco in tali composti, su cellule tumorali umane di melanoma maligno in stato primario (A375) e in metastasi (SK-MEL-28), e di cancro della cervice uterina (HeLa), mediante il saggio MTT (Aquino et al., 2014). L’estratto ha mostrato un significativo e concentrazione-dipendente effetto citotossico su tutte le linee cellulari (con IC50 tra 459 e 584 µg/mL) inducendo l’apoptosi attraverso attivazione della caspasi-3, dimostrandosi, quindi, un buon candidato per formulazioni utili nella prevenzione dell’insorgenza di neoplasie.
L’estratto di pellicine di nocciola e la sua frazione arricchita in proantocianidine sono risultati efficaci (MIC2 = 3,00 e 0,10 μg/mL e MIC0 = 5,00 e 0,50 μg/mL, rispettivamente, determinata con il metodo delle microdiluizioni in brodo e analisi morfologica microscopica) contro Candida albicans, fungo patogeno opportunistico che si ritrova come inquinante in prodotti alimentari e di consumo (cosmetici) e provoca infezioni a carico della cute e delle mucose nell’uomo. L’estratto e la sua frazione arricchita potrebbero essere quindi utilizzati come bio-conservanti, o ingredienti attivi in alimenti, o in formulazioni destinate all’uso topico.
Gli estratti di ricci di castagna sono risultati efficaci inibitori (a concentrazioni tra 6.29 e 15.51 mg/mL) della crescita del micelio e della germinazione delle spore di alcuni ceppi di funghi fitopatogeni (in particolare Alternaria alternata e Fusarium solani). I buoni risultati ottenuti sono supportati da diversi lavori in letteratura che riportano l’efficacia di estratti vegetali, ricchi in polifenoli, nei confronti di funghi patogeni che, in fase di coltivazione e in post-raccolta, causano deterioramento delle derrate alimentari (frutta e verdura), con conseguente danno economico per la filiera agricola e potenziale pericolo per la salute del consumatore…